Quantificação da resistência aos antibióticos mediada por plasmídeos em uma abordagem de evolução experimental

Plasmídeos são elementos extracromosomais que são onipresentes na maioria das espécies e habitats bacterianos onde são agentes muito importantes da transferência de genes laterais, pois podem migrar entre as células e entre populações. Um dos exemplos mais marcantes e proeminentes dessa transferência é a disseminação de genes de resistência a antibióticos que são codificados em plasmídeos. Para construir um plasmídeo modelo que codifica um gene de resistência a antibióticos, escolha uma espinha dorsal plasmida e PCR amplifice a espinha dorsal usando uma polimerase de alta fidelidade e primers que se ligam no modelo plasmídeo. No nosso caso, usamos uma espinha dorsal plasmida pBBR1. Em seguida, amplifique o gene de resistência nptII incluindo o promotor nativo Tn5 usando uma polimerase de alta fidelidade. Projete os primers para o gene de resistência com aproximadamente 20 pares de base de complementaridade de sequência à espinha dorsal plasmida. Após os PCRs, mescla a região de homologia do produto PCR do gene de resistência purificada ao backbone plasmídeo purificado usando montagem isotermal a 50 graus por 60 minutos. Transforme o produto fundido em E.Coli DH5-Alpha usando eletroporação. Placa 100 microliter da mistura em mídia seletiva e incubar a 37 graus por cerca de 24 horas. O plasmídeo pode então ser extraído, validado e transformado na cepa do tipo selvagem E.coli MG1655. Isso produz cepa MG1655 pCON.Durante a exposição a antibióticos, as bactérias precisam do plasmídeo para sobreviver. Assim, o plasmídeo está sob seleção positiva. Em condições não-seletivas, portanto, sem antibióticos, o plasmídeo é descartável para a célula. O objetivo do nosso estudo foi seguir os plasmídeos sob tais condições não-seletivas ao longo do tempo. Para isso, equipamos os pequenos plasmídeos com um gene de resistência a antibióticos e introduzimos-no a Escherichia coli. Realizamos um experimento evolutivo e monitoramos a frequência dos plasmídeos através de um revestimento de réplicas. O plasmídeo que carrega cepa mg1655 pCON é agora introduzido em um experimento de evolução. Primeiro, placa de mg1655 pCON em placas de ágar LB suplementadas com antibióticos e incubar durante a noite a 37 graus. A partir desta placa escolha aleatoriamente as 8 colônias ancestrais e incubar durante a noite a 37 graus com agitação constante. No dia seguinte, as populações são transferidas para o experimento que é realizado em 96 placas de poços profundos. É altamente importante distribuir aleatoriamente as réplicas através da placa. Por exemplo, em uma abordagem de tabuleiro de xadrez. Em nosso experimento as culturas são diluídas e transferidas com diferentes taxas de diluição e em duas temperaturas. Durante cada evento de transferência, o tratamento de diluição é aplicado e a transferência serial é repetida ao longo de um total de 98 transferências. Ao longo do experimento de evolução, a frequência de plasmídeos na população é estimada a partir da proporção de células portadoras de plasmídeos. O revestimento de réplica foi popularizado por Esther e Joshua Lederberg na década de 1950, onde o usaram para estudar a resistência a medicamentos em bactérias. O método permitirá que eles melhorem sua varredura para fenótipos e, ao final do estudo, revelou que a resistência à penicilina pode surgir em bactérias devido a mutações espontâneas no genoma. Para determinar a frequência plasmida na população durante o experimento, as culturas estacionárias são diluídas e banhadas em placas de ágar LB não seletivas. Ajuste a diluição de acordo com um rendimento de 250 a 500 colônias por placa. As populações banhadas são incubadas para crescimento noturno a 37 graus por menos de 24 horas. Colônias são melhor replicadas quando ainda são pequenas. Após o crescimento da noite para o dia, todas as colônias utilizam um contador de colônias automatizados da escolha do leitor. Isso produz o tamanho total da população de bactérias nas culturas. Note que as colônias na borda da placa devem ser deixadas de fora. Para replicar as placas, você precisa de placas de ágar seletivas complementadas com antibióticos, um bloco redondo, um anel de metal que se encaixa no bloco, e pano de veludo estéril. O pano precisa ser 100% algodão, pois isso pode ser esterilizado por autoclavação. Coloque o pano no bloco e fixe-o com o anel de metal.Coloque cuidadosamente a placa com as colônias contadas na superfície fixa do pano de veludo. Toque na placa em movimentos circulares para que toda a superfície da placa toque no pano. É muito importante que todas as colônias toquem o veludo. Retire a placa LB e coloque a placa seletiva no veludo. Repita a batida cuidadosa. É novamente importante que a placa toque completamente o veludo. Depois, remova a placa seletiva. As placas são incubadas à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, tanto o LB quanto a placa de antibióticos são necessários para avaliação. Coloque as placas uma acima da outra e compare o crescimento. Você pode facilmente detectar espaços livres de colônias. Estas são as colônias que não são resistentes aos antibióticos. Assim, essas colônias perderam o plasmídeo. No final, marque quantas colônias estão faltando na placa de antibióticos. Este número lhe dá a perda plasmida. Repita a réplica de todas as populações durante o experimento de evolução semanalmente. A perda plasmida pode ser causada por multiformação plasmida. Ao trabalhar em uma construção plasmida dizer para a expressão de um determinado gene em seu hospedeiro preferido tensão o comportamento nativo de um plasmid in vivo no que diz respeito à confirmação que um estado pode tomar é geralmente algo que é negligenciado. Mas, em um contexto evolutivo, tal confirmação de mudanças pode ser de grande importância. A análise das confirmações plasmid pode ser um esforço muito complicado. Especialmente multimers plasmídeos são difíceis de analisar porque não podem ser identificados adequadamente pelo PCR ou por sequenciamento. Por outro lado, multimers plasmídeos são difíceis de analisar por eletroforese de gel devido ao seu tamanho potencialmente grande e sua lenta mobilidade eletroforética. Nosso protocolo oferece um método simples e simples para a triagem e identificação de multimers plasmídeos em que eu diria qualquer preparação plasmida. Para as moléculas de plasmídeo visual extrair o plasmídeo de 5 mL cultura celular estacionária durante a noite usando lise alcalina. A extração plasmida de plasmídeos de cópia baixa muitas vezes leva à contaminação com DNA cromossômico hospedeiro que precisa ser digerido antes da visualização. Para remover a contaminação cromossômica do DNA, trate o DNA plasmídeo extraído com Plasmid-Safe