Name: Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Aprenda a medir interações transcelulares de proteínas de adesão usando células HEK-293T e microscopia de fluorescência. Este método semiquantitativo permite avaliar rapidamente mutações em moléculas de adesão relevantes para neurobiologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por Subsídios do Instituto Nacional de Saúde Mental (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), bolsa de formação pré-doutorado do Instituto Nacional de Medicina Geral (T32GM007635 a S.R.), e uma Bolsa Lyda Hill Gilliam para Estudos Avançados (GT11021 a S.R.). Agradecemos ao Dr. Kevin Woolfrey pela ajuda com o microscópio, Dr. K Ulrich Bayer pelo uso de seu microscópio epifluorescente, e Thomas Südhof (Universidade de Stanford) para o plasmídeo LRRTM2.

1. Cultura celular e transfecção
<ol><li>Faça mídia celular HEK com DMEM, 1x (Modificação do Meio da Águia) de Dulbecco com glicose de 4,5 g/L, l-glutamina & piruato de sódio e 10% FBS. Filtro estéril.</li>
	<li>Ligantes e receptores adequados para agregação de pré-determinantes e receptores para ensaio de agregação. NOTA: Neurexin3α SS4+/- e um de seus ligantes conhecidos, LRRTM2, foram utilizados neste estudo. Ligantes e receptores de interesse foram expressos a partir de cDNAs em pcDNA3.1. Um conjunto Gibson foi usado para inserir Neurexin3α no pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCCTACTC/ GAGCGGCCGCCCCGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Prepare células HEK293T.<ol>
<li>Cresça células HEK293T para confluência em um frasco T-75.</li>
		<li>Uma vez confluente, use 2 mL de trippsina e coloque em incubadora de 37 °C por 2 min. Adicione 6 mL de mídia HEK ao frasco para resuspend células e transfira todos os 8 mL para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Pelota a 500 x g por 5 min e resuspend na mídia de células HEK para um total de 8 mL.</li>
		<li>Conte células e adicione 735.000 células em cada poço de uma placa de 6 poços. Ajuste o volume final para 2 mL para cada poço usando mídia de célula HEK.</li>
		<li>Coloque na incubadora de 37 °C e permita que as células cresçam durante a noite ou até atingirem 50-60% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Células HEK293T transfectas utilizando o método fosfato de cálcio13.<ol>
<li>Transfetar bem-1 com 3 μg da proteína de interesse e co-transfeto com 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg de mCherry).</li>
		<li>Transfect well-2 como na etapa 1.4.1. mas com a proteína mutante de interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfect well-3 com 3 μg do ligante de interesse e co-transfeito com 1 μg de outra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg de GFP).</li>
		<li>Transfect well-4 e well-5 para servir como controles negativos: bem-4 com 1 μg de GFP e bem-5 com 1 μg de mCherry.</li>
		<li>Prepare outra placa (como na etapa 1.4.1-1.4.4) se exigir condições ou controles adicionais (Neurexin3αWT/A687T SS4+). NOTA: A eficiência da transfecção é analisada 24 h após a transfecção sob um microscópio de epifluorescência e quantificada como o número de células expressando a proteína fluorescente com a qual foram transfecidas. Uma abordagem mais simplificada incluiria a transfecção de células HEK com uma codificação vetorial bicistrônica para uma proteína fluorescente e o ligante de interesse e é altamente recomendado acima da co-transfecção. No caso deste estudo, as neurexinas alfa são ~4,3 kb e a baixa intensidade de fluorescência foi observada usando um sistema bicistronic que necessita de co-transfecção.</li>
	</ol></li>
	<li>48 horas após a transfecção, colhe células para agregação.<ol>
<li>Lave cada poço duas vezes com PBS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 10 mM EDTA em PBS em cada poço para dissociar suavemente as interações célula-célula e incubar a placa a 37 °C por 5 minutos. NOTA: A trippsina não é recomendada para a etapa 1.5.2 devido ao potencial decote proteolítico de moléculas de adesão em estudo. Além disso, após a adição de EDTA, o protocolo pode não ser interrompido até a conclusão, pois as células serão agora expostas a condições ambientais.</li>
		<li>Bata suavemente a placa para desprender as células e colher cada poço em tubos cônicos separados de 15 mL.</li>
		<li>Centrífuga tubos cônicos a 500 x g e temperatura ambiente por 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Enquanto as células estão pelotando, prepare 6 tubos de incubação rotulando a parte superior de cada tubo de microcentrifuuagem com cada condição. NOTA: Cada permutação das condições de GFP e mCherry deve ser usada para abranger todas as condições experimentais e controles adequados. Por exemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-- mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-— mCherry/LRRTM2 — GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Faça tubos adicionais para acomodar outras condições e controles.</li>
	<li>Remova as células supernascidas e resuspend em 500 μL de mídia HEK com 10 mM CaCl2 e 10 mM MgCl2 aquecidos a 37 °C. NOTA: A adição de CaCl2 e MgCl2 permite que moléculas de adesão restabeleçam a vinculação e só é necessária se os parceiros de interação transcelular em questão exigirem cáções divalentes para adesão.</li>
	<li>Conte as células em cada tubo cônico de 15 mL usando um hemocitômetro e alíquota de 200.000 células de cada condição em tubo apropriado a partir da etapa 1.6.1 para uma mistura de 1:1 em um volume total de 500 μL. NOTA: Deve levar apenas 5 minutos por condição para contar e parcelar valores.</li>
	<li>Incubar tubos à temperatura ambiente em um rotador de tubo lento.</li>
</ol>2. Aquisição de imagens
<ol><li>Otimize parâmetros de aquisição de microscópio para amostras específicas. Neste exemplo, as imagens foram tiradas em um microscópio de campo largo. Use um objetivo de ar 5x (NA: 0,15; WD: 20000 μm) para obter um campo grande o suficiente para análise.</li>
	<li>Avalie a agregação da linha de base imediatamente após misturar as duas condições das células HEK na etapa 1.8. Estas são agora as imagens do "tempo zero".<ol>
<li>Pipeta 40 μL de cada mistura de amostra em um slide de microscópio carregado e imagem sob fluorescência nos canais 488 e 561.</li>
		<li>Adquira três diferentes campos de visão em um plano focal por gota de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquira imagens finais a 60 min como a imagem do "tempo 60".<ol>
<li>Para obter a imagem 'time 60' da mistura após uma incubação de 60 minutos, pegue outra amostra de 40 μL de cada condição a partir de tubos rotativos e pipeta cada amostra em um slide carregado. Imagem como na etapa 2.2.2. NOTA: A agregação celular deve ser verificada a cada 15 minutos até que ocorra a saturação. O tempo de agregação dependerá das proteínas que estão sendo testadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise ImageJ/Fiji
<ol><li>Para quantificar a extensão da agregação usando Fiji/ImageJ, salve arquivos de análise.<ol>
<li>Salve os arquivos de codificação suplementar fornecidos na pasta de macros imageJ no computador.</li>
		<li>Instale a macro de agregação fornecida (Plugins, Macros, Install e selecione o arquivo "AgregaçãoSsay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine limiares.<ol>
<li>Carregue um arquivo de .tif 'time zero' em imageJ e divida os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos). NOTA: A imagem 'time zero' é usada para determinar o limiar e o menor tamanho de puncta para todo o experimento.</li>
		<li>Mascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). A janela Make Mask From Image será exibida. Verifique as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e clique em OK.</li>
		<li>Determine o limiar da imagem usando a barra de slides, grave o número à direita da barra de slides e clique em OK.</li>
		<li>Um Histograma do Tamanho do Cluster aparecerá. Selecione um tamanho de cluster do histograma que se adapte ao experimento, digite este número no Tamanho do Cluster Min: caixa e clique em OK. Clusters abaixo deste tamanho não serão analisados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a análise.<ol>
<li>Abra a imagem 'time 60' da condição 1 na imagemJ e divida os canais como na etapa 3.2.1.</li>
		<li>Mascarar cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Use o mesmo limiar e tamanho determinados na etapa 3.2.3 e na etapa 3.2.4. Desmarque as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params do Histograma e digite manualmente o tamanho e os limiares nos campos apropriados e clique em OK.</li>
		<li>Calcular o índice de agregação (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selecione os canais mascarados a serem comparados e o diretório no qual os arquivos resultantes serão salvos.</li>
		<li>Repita as etapas 3.3.1-3.3.3 para cada imagem 'time 60' em cada condição. NOTA: O índice de agregação é definido como a área de sobreposição total dividida pela soma das duas áreas de canal menos a área de sobreposição multiplicada por 100 (Índice de agregação = área de sobreposição/[área do canal 1 + área do canal 2 – área de sobreposição] x 100). Esta normalização é uma operação 'OR' entre os dois canais mascarados representando os pixels totais em qualquer máscara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Dissecar as interações proteína-proteína que ocorrem em trans durante a adesão celular pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes aos processos celulares básicos, incluindo a formação, função e manutenção de sinapses durante a maturação e remodelação. As implicações das interações célula-célula se expandem além da neurobiologia e têm papéis mais amplos na transdução de sinais, migração celular e desenvolvimento de tecidos14. Aberrações na adesão celular podem interr...

Interações sinápticas facilitadas por moléculas de adesão sináptica são fundamentais para o desenvolvimento, organização, especificação, manutenção e função das sinapses e da geração de redes neurais. A identificação dessas moléculas de adesão celular transsináptica está aumentando rapidamente; assim, é fundamentalmente importante identificar parceiros vinculantes e entender como essas novas moléculas de adesão interagem entre si. Além disso, o sequenciamento do genoma identificou mutações em muitas dessas moléculas de adesão que estão comumente ligadas a uma infinidade de distúrbios neurodesenvolvimentos, neuropsiquiátricos e de dependência1. Mutações em genes que codificam moléculas de adesão celular sináptica podem alterar prejudicialmente interações trans e podem contribuir para alterações fiofoficológicas na formação e ou manutenção da sinapse.
Existem ensaios múltiplos para avaliar quantitativamente interações proteína-proteína, como calrómetria isotérmica, dicromaísmo circular, ressonância de plasmon superficial2 e, embora quantitativa na natureza, eles têm várias limitações. Primeiro, eles requerem proteína recombinante, às vezes exigindo passos longos e tediosos de purificação. Em segundo lugar, exigem equipamentos especializados sofisticados e conhecimentos técnicos. Em terceiro lugar, eles podem superestimar a extensão da ligação, pois permitem interações cis e trans entre proteínas que são naturalmente amarradas a uma membrana in vivo. Aqui propomos um ensaio simples e relativamente rápido que testa exclusivamente interações trans.
Para contornar muitas das complicações associadas a ensaios proteicos purificados, otimizamos um ensaio de interação proteica baseado em células que recapitula interações trans em um sistema celular heterologos reduzido. Este ensaio tem sido usado anteriormente de várias formas para estudar interações transcelulares. Nesta abordagem, moléculas de adesão celular candidatas são transfectadas em células HEK293T. Em condições fisiológicas, as células HEK293T não apresentam auto-agregação, tornando-as modelos exemplares para este ensaio. No entanto, quando populações individuais de células HEK expressando receptor e ligante são combinadas, a ligação do receptor e do ligante força a agregação de células HEK a ocorrer. Esta agregação é mediada exclusivamente por interações trans e geralmente é observável em dezenas de minutos. Não são necessárias etapas de purificação de proteínas neste método, e a eficiência do método baseia-se no paradigma de que populações de células HEK expressando moléculas de adesão cogna estão sendo combinadas e, em seguida, imagens apenas dezenas de minutos depois. Além disso, este método é relativamente barato, pois nem anticorpos nem equipamentos caros são necessários. O único equipamento necessário para a aquisição de dados é um microscópio fluorescente padrão. Uma vantagem adicional para este ensaio baseado em células é a capacidade de rastrear rapidamente o efeito de mutações de pontos relevantes da doença nas interações trans. Isso pode ser realizado transfecando células HEK com cDNAs das variantes mutantes da proteína de interesse.
Neste protocolo, apresentamos um exemplo no qual investigamos se uma mutação missense em Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificada em um paciente diagnosticado com profunda deficiência intelectual e epilepsia, altera interações em trans com proteína trans trans reito transmembrana 2 (LRRTM2). Neurexin3α é um membro da família evolutivamente conservada de moléculas de adesão celular pré-sináptica e, embora o trabalho recente tenha identificado múltiplos papéis na sinapse3,4,5,6,7, nossa compreensão sináptica desta molécula e todos os membros da família neurexina permanecem incompletos. LRRTM2 é uma proteína de adesão celular pós-sináptica excitatória que participa da formação e manutenção da sinapse8,9,10. É importante ressaltar que o LRRTM2 interage exclusivamente com isoformas de neurexina que não possuem o local da emenda 4 exon alternativo (SS4-), mas não com isoformes de neurexina contendo o local da emenda 4 exon alternativo (SS4+). A mutação missense humana (A687T) identificada em Neurexin3α está localizada em uma região extracelular não estudada que é evolutivamente conservada e é conservada entre todas as neurexinas alfa7. Como a interação entre essas duas moléculas foi estabelecida8,9,11, colocamos a questão: a capacidade de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2 é alterada por uma mutação de ponto A687T? Este ensaio revelou que a mutação de ponto A687T aumentou inesperadamente a agregação de Neurexin3α para LRRTM2 sugerindo que a região extracelular em que a mutação de ponto está localizada, desempenha um papel na mediação de interações transsinápticas.

<table><tbody><tr><td>Microtubos descartáveis de 1,5 mL com tampas de pressão</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubação de população mista de células HEK</td></tr><tr><td>1000 mL Rápido&mdash; Unidade de filtro de fluxo, membrana aPES de 0,2 um</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Esterilização de meios HEK</td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga SpectraTube</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>Colheita de células HEK</td></tr><tr><td>6 placas de cultura de tecidos estéreis VWR</td><td></td><td>100062-892</td><td>cultura de células HEK</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Transfecção de fosfato de cálcio, ressuspensão de células HEK</td></tr><tr><td>Centrífuga - Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Produtos de laboratório</td><td>75004377</td><td>Colheita de células HEK</td></tr><tr><td>Incubadora</td> <td>de células CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubação de células HEK durante o crescimento</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Manutenção de células HEK</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato Tampolado com Solução Salina PBS (1X)</td> <td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passagem / colheita de células HEK</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Colheita de células HEK</td></tr><tr><td>Falcão Frascos de cultura ventilados, área de crescimento de 75 cm 2</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Cultivo de células HEK</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>Manutenção</td></tr> <tr>de células HEK<td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td></td><td>Sistema modelo</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69 / 1.52p</td><td>Análise de imagem</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>Ressuspensão de células HEK</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico anidro</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Transfecção de fosfato de cálcio</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% (1X) Solução</td><td>GE Healthcare Life Ciências</td><td>SH30042.01</td><td>Células HEK passageiras</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td><td>de tubos Incubação de população mista de células HEK</td></tr><tr><td>UltraClear Lâminas de microscópio. Branco fosco, carregado positivamente</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Aquisição de imagem Microscópio de campo amplo</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Aquisição de imagem</td></tr></tbody></table>

medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

As interações proteicas nas interfaces celulares ditam uma infinidade de desfechos biológicos que vão desde o desenvolvimento de tecidos e progressão do câncer até a formação e manutenção da sinapse. Muitas dessas interações fundamentais ocorrem em trans e são tipicamente induzidas por interações heterofílicas ou homofílicas entre células expressando pares de ligação ancorados na membrana. Elucidar como mutações relevantes para doenças interrompem essas interações proteicas fundamentais pode fornecer uma visão de uma miríade de campos de biologia celular. Muitos ensaios de interação proteína-proteína não normalmente desambiguam entre interações cis e trans, o que potencialmente leva a uma superestimação da extensão da ligação que está ocorrendo in vivo e envolve purificação intensiva de proteínas e/ou equipamentos de monitoramento especializados. Aqui, apresentamos um protocolo simples otimizado que permite a observação e quantificação de apenas interações trans sem a necessidade de purificações de proteínas longas ou equipamentos especializados. O ensaio de agregação celular HEK envolve a mistura de duas populações independentes de células HEK, cada uma expressando ligantes cognatos ligados à membrana. Após um curto período de incubação, as amostras são imagens e os agregados resultantes são quantificados.

A mutação A687T aumenta a ligação Neurexin3α SS4 ao LRRTM27 Para investigar como as interações intercelulares de duas proteínas sinápticas conhecidas são afetadas pela introdução de uma mutação pontual encontrada em um paciente com deficiência intelectual e epilepsia, utilizamos o ensaio de agregação celular HEK acima(Figura 1). As células foram transfeinadas de acordo com a seção 1 e preparadas para imagens de acordo com as seções 1 e 2 do protocolo. As célula...

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

O ensaio baseado em células permite a observação e quantificação de interações de adesão trans sem a necessidade de longas purificações de proteínas ou equipamentos especializados. Embora as interações proteicas testadas aqui sejam relevantes para a neurobiologia, este método pode ser aplicado a qualquer área de pesquisa em que a adesão proteica esteja ocorrendo intercelularmente. 48 horas após a transfecção das células HEK-293T, colha as células da placa de seis poços para agregação.Primeiro, lave cada poço duas vezes com PBS. Em seguida, para dissociar suavemente as células, adicione um mililitro de EDTA 10 milimolar a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius. Após cinco minutos de incubação, bata suavemente na placa para separar as células e colha cada poço em um tubo cônico separado de 15 mililitros.Centrifugar os tubos a 500 x g à temperatura ambiente durante cinco minutos. Enquanto as células estão peletizando, prepare seis tubos de incubação rotulando os topos dos tubos de microcentrífuga com as condições experimentais. Todas as permutações de GFP e mCherry devem ser usadas.Remova o sobrenadante dos tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspenda as células em 500 microlitros de meio. Usando um hemocitômetro, conte as células em cada tubo cônico. Em seguida, alíquota de 200.000 células de cada condição no tubo de incubação apropriado para uma mistura um-para-um em um volume total de 500 microlitros.Depois de avaliar a agregação basal descrita na próxima seção, coloque os tubos de incubação em um rotador de tubo lento à temperatura ambiente. Para avaliar a agregação, no início e novamente após 60 minutos, pipete 40 microlitros do tubo de incubação para uma lâmina de microscópio carregada. A aquisição da linha de base deve ser feita o mais rápido possível após a adição de células ao tubo da microcentrífuga.Visualize o slide sob fluorescência nos canais verde e vermelho. Para cada slide, capture imagens de três campos de visão diferentes em um plano focal. As células HEK-293T foram transfectadas com uma proteína de interesse, uma proteína mutada de interesse ou um ligante de interesse e co-transfectadas com uma proteína fluorescente.As populações de células que expressam a proteína de interesse foram misturadas com populações de células que expressam o ligante de interesse e avaliadas quanto à agregação após 60 minutos. Nas sobreposições de imagens capturadas nos canais verde e vermelho, a agregação aparece como pontos amarelos. As condições nas quais as células não expressavam nenhum ligante sináptico mostraram agregação mínima.Além disso, a agregação mínima foi exibida quando apenas uma das duas populações estava expressando ligantes sinápticos. Nenhuma agregação foi exibida quando as duas populações de células expressaram moléculas de adesão incompatíveis. Condições com moléculas de adesão compatíveis exibiram agregação significativa após uma incubação de 60 minutos.Surpreendentemente, a proteína mutada de interesse exibiu significativamente mais agregação do que sua contraparte do tipo selvagem, sugerindo que a mutação pontual aumenta as capacidades de ligação às proteínas. Mutações em muitas moléculas de adesão são comumente ligadas a distúrbios do neurodesenvolvimento, neuropsiquiátricos e de dependência. Com esta técnica, pode-se rastrear os efeitos de mutações pontuais relevantes para doenças nas interações trans.

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de agregação de proteínas baseado em células usando inibidores de proteassoma, que bloqueiam a atividade do proteassoma, impedindo que proteínas mutantes mal dobradas, fundidas a um rótulo fluorescente, sofram degradação proteassômica dependente de ubiquitina, levando ao seu acúmulo dentro do citoplasma celular. Os agregados proteicos são então visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência.

Ensaio de Formação de Agregados de Proteínas: Um Método para Detectar e Quantificar a Agregação de Proteínas em Células Cultivadas após Indução por Inibidor de Proteassoma

Neste vídeo, demonstramos a técnica para medir as interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica por meio do ensaio de agregação de células HEK. Neste ensaio, um número igual de células HEK expressando uma molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e uma proteína fluorescente são misturadas com células HEK expressando uma molécula de adesão celular pós-sináptica e outra proteína fluorescente. A interação entre as moléculas de adesão celular força as células a se...

Ensaio de agregação celular para detectar interações trans entre moléculas de adesão celular

Neste vídeo, demonstramos a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear na célula para estudar as interações proteína-ligante entre proteínas superexpressas não marcadas e pequenas moléculas. A interação ligante-proteína bem-sucedida é confirmada visualmente pelo aparecimento de um conjunto adicional de picos na região espectral de interesse que substitui gradualmente os picos originais.

Espectroscopia quantitativa de RMN de hidrogênio na célula para monitorar interações proteína-ligante

Viabilidade celular depende de uma gestão eficiente e oportuna de misfolding proteína. Descrevemos aqui um método para a visualização dos diferentes destinos potenciais de uma proteína misfolded: redobramento, degradação, ou sequestração de inclusões. Nós demonstramos a utilização de um sensor de dobragem,...

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

Aqui apresentamos um método simples e rápido para caracterizar as propriedades adesivas intrínsecas de moléculas putativas de adesão celular.  O ectodomínio secretado e marcado com epítopos de uma molécula de adesão celular é capturado do meio de cultura em grânulos funcionalizados pequenos e uniformes.  Esses grânulos podem então ser usados imediatamente em ensaios simples de agregação de grânulos.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Aprenda a medir interações transcelulares de proteínas de adesão usando células HEK-293T e microscopia de fluorescência. Este método semiquantitativo permite avaliar rapidamente mutações em moléculas de adesão relevantes para neurobiologia.

Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Explorar mais vídeos