Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

O ensaio baseado em células permite a observação e quantificação de interações de adesão trans sem a necessidade de longas purificações de proteínas ou equipamentos especializados. Embora as interações proteicas testadas aqui sejam relevantes para a neurobiologia, este método pode ser aplicado a qualquer área de pesquisa em que a adesão proteica esteja ocorrendo intercelularmente. 48 horas após a transfecção das células HEK-293T, colha as células da placa de seis poços para agregação.

Primeiro, lave cada poço duas vezes com PBS. Em seguida, para dissociar suavemente as células, adicione um mililitro de EDTA 10 milimolar a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius. Após cinco minutos de incubação, bata suavemente na placa para separar as células e colha cada poço em um tubo cônico separado de 15 mililitros.

Centrifugar os tubos a 500 x g à temperatura ambiente durante cinco minutos. Enquanto as células estão peletizando, prepare seis tubos de incubação rotulando os topos dos tubos de microcentrífuga com as condições experimentais. Todas as permutações de GFP e mCherry devem ser usadas.

Remova o sobrenadante dos tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspenda as células em 500 microlitros de meio. Usando um hemocitômetro, conte as células em cada tubo cônico. Em seguida, alíquota de 200.000 células de cada condição no tubo de incubação apropriado para uma mistura um-para-um em um volume total de 500 microlitros.

Depois de avaliar a agregação basal descrita na próxima seção, coloque os tubos de incubação em um rotador de tubo lento à temperatura ambiente. Para avaliar a agregação, no início e novamente após 60 minutos, pipete 40 microlitros do tubo de incubação para uma lâmina de microscópio carregada. A aquisição da linha de base deve ser feita o mais rápido possível após a adição de células ao tubo da microcentrífuga.

Visualize o slide sob fluorescência nos canais verde e vermelho. Para cada slide, capture imagens de três campos de visão diferentes em um plano focal. As células HEK-293T foram transfectadas com uma proteína de interesse, uma proteína mutada de interesse ou um ligante de interesse e co-transfectadas com uma proteína fluorescente.

As populações de células que expressam a proteína de interesse foram misturadas com populações de células que expressam o ligante de interesse e avaliadas quanto à agregação após 60 minutos. Nas sobreposições de imagens capturadas nos canais verde e vermelho, a agregação aparece como pontos amarelos. As condições nas quais as células não expressavam nenhum ligante sináptico mostraram agregação mínima.

Além disso, a agregação mínima foi exibida quando apenas uma das duas populações estava expressando ligantes sinápticos. Nenhuma agregação foi exibida quando as duas populações de células expressaram moléculas de adesão incompatíveis. Condições com moléculas de adesão compatíveis exibiram agregação significativa após uma incubação de 60 minutos.

Surpreendentemente, a proteína mutada de interesse exibiu significativamente mais agregação do que sua contraparte do tipo selvagem, sugerindo que a mutação pontual aumenta as capacidades de ligação às proteínas. Mutações em muitas moléculas de adesão são comumente ligadas a distúrbios do neurodesenvolvimento, neuropsiquiátricos e de dependência. Com esta técnica, pode-se rastrear os efeitos de mutações pontuais relevantes para doenças nas interações trans.