Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous
22 de maio de 2020
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.
O ensaio baseado em células permite a observação e quantificação de interações de adesão trans sem a necessidade de longas purificações de proteínas ou equipamentos especializados. Embora as interações proteicas testadas aqui sejam relevantes para a neurobiologia, este método pode ser aplicado a qualquer área de pesquisa em que a adesão proteica esteja ocorrendo intercelularmente. 48 horas após a transfecção das células HEK-293T, colha as células da placa de seis poços para agregação.
Primeiro, lave cada poço duas vezes com PBS. Em seguida, para dissociar suavemente as células, adicione um mililitro de EDTA 10 milimolar a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius. Após cinco minutos de incubação, bata suavemente na placa para separar as células e colha cada poço em um tubo cônico separado de 15 mililitros.
Centrifugar os tubos a 500 x g à temperatura ambiente durante cinco minutos. Enquanto as células estão peletizando, prepare seis tubos de incubação rotulando os topos dos tubos de microcentrífuga com as condições experimentais. Todas as permutações de GFP e mCherry devem ser usadas.
Remova o sobrenadante dos tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspenda as células em 500 microlitros de meio. Usando um hemocitômetro, conte as células em cada tubo cônico. Em seguida, alíquota de 200.000 células de cada condição no tubo de incubação apropriado para uma mistura um-para-um em um volume total de 500 microlitros.
Depois de avaliar a agregação basal descrita na próxima seção, coloque os tubos de incubação em um rotador de tubo lento à temperatura ambiente. Para avaliar a agregação, no início e novamente após 60 minutos, pipete 40 microlitros do tubo de incubação para uma lâmina de microscópio carregada. A aquisição da linha de base deve ser feita o mais rápido possível após a adição de células ao tubo da microcentrífuga.
Visualize o slide sob fluorescência nos canais verde e vermelho. Para cada slide, capture imagens de três campos de visão diferentes em um plano focal. As células HEK-293T foram transfectadas com uma proteína de interesse, uma proteína mutada de interesse ou um ligante de interesse e co-transfectadas com uma proteína fluorescente.
As populações de células que expressam a proteína de interesse foram misturadas com populações de células que expressam o ligante de interesse e avaliadas quanto à agregação após 60 minutos. Nas sobreposições de imagens capturadas nos canais verde e vermelho, a agregação aparece como pontos amarelos. As condições nas quais as células não expressavam nenhum ligante sináptico mostraram agregação mínima.
Além disso, a agregação mínima foi exibida quando apenas uma das duas populações estava expressando ligantes sinápticos. Nenhuma agregação foi exibida quando as duas populações de células expressaram moléculas de adesão incompatíveis. Condições com moléculas de adesão compatíveis exibiram agregação significativa após uma incubação de 60 minutos.
Surpreendentemente, a proteína mutada de interesse exibiu significativamente mais agregação do que sua contraparte do tipo selvagem, sugerindo que a mutação pontual aumenta as capacidades de ligação às proteínas. Mutações em muitas moléculas de adesão são comumente ligadas a distúrbios do neurodesenvolvimento, neuropsiquiátricos e de dependência. Com esta técnica, pode-se rastrear os efeitos de mutações pontuais relevantes para doenças nas interações trans.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente interações ligando-receptor em trans, usando uma abordagem de microscopia de fluorescência em células HEK-293T. O método permite a quantificação de interações de adesão proteica relevantes para a neurobiologia e potencialmente outras áreas de pesquisa.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurobiologia
- Adesão celular
- Interações proteicas
Fundamentos
- Interações ligando-receptor são críticas para a comunicação celular.
- Entender essas interações ajuda a elucidar mecanismos de distúrbios neurodesenvolvimentais e neuropsiquiátricos.
- Métodos tradicionais podem exigir purificação extensiva de proteínas ou equipamentos especializados.
- Este estudo propõe uma abordagem mais eficiente usando microscopia de fluorescência.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um protocolo rápido e eficaz para estudar a adesão proteica em um ensaio baseado em células.
- Avaliar como mutações pontuais em proteínas influenciam interações em trans.
- Aplicar este método amplamente em estudos de adesão proteica fora da neurobiologia.
Métodos Utilizados
- Microscopia de fluorescência foi empregada para imagens de interações celulares.
- Células HEK-293T foram usadas como modelo biológico, focando em proteínas transfectadas e ligantes.
- O cronograma experimental envolveu avaliação de agregação celular após 60 minutos pós-transfecção.
- Contagem celular foi realizada usando um hemocitômetro, seguido por ressuspensão e mistura celular para imagem.
Principais Resultados
- A agregação de células expressando moléculas de adesão compatíveis foi significativamente melhorada após 60 minutos.
- Proteínas mutantes mostraram maior agregação comparadas às contrapartes selvagens, indicando capacidades de ligação aprimoradas.
- Agregação mínima foi observada quando nenhuma ou apenas uma população expressava ligantes sinápticos.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método simplificado para avaliar interações adesivas intercelulares.
- As descobertas destacam o potencial desta técnica na exploração dos efeitos de mutações nas interações proteicas.
- Insights deste método são valiosos para entender mecanismos subjacentes a vários distúrbios neurodesenvolvimentais e psicológicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
