Ensaio de Formação de Agregados de Proteínas: Um Método para Detectar e Quantificar a Agregação de Proteínas em Células Cultivadas após Indução por Inibidor de Proteassoma

A remoção de proteínas mal dobradas na célula é regulada principalmente pelo sistema ubiquitina-proteassoma celular, em que a proteína é primeiro reconhecida e marcada pela ubiquitina, uma pequena proteína reguladora, e traficada para o proteassoma, um complexo multiproteico, para hidrólise e depuração.

A atividade prejudicada do sistema ubiquitina-proteossomo, uma ocorrência comum em doenças neurodegenerativas, pode fazer com que proteínas mal dobradas se acumulem dentro das células, formando agregados de proteínas insolúveis com efeitos citotóxicos.

Para visualizar e quantificar a agregação de proteínas in vitro, obtenha uma suspensão de células de mamíferos transduzidas - expressando uma proteína mutante marcada com fluorescência que adota uma conformação mal dobrada com resíduos hidrofóbicos expostos - em meios adequados.

Pipete concentrações crescentes de um inibidor de proteassoma para os poços de uma placa preta de vários poços para minimizar a fluorescência de fundo durante a imagem. Semeie a suspensão de células de mamíferos nos poços. Incube para permitir que as células adiram ao fundo da placa e proliferem.

Uma vez dentro, o inibidor do proteassoma se liga aos sítios pro