Ensaio de Formação de Agregados de Proteínas: Um Método para Detectar e Quantificar a Agregação de Proteínas em Células Cultivadas após Indução por Inibidor de Proteassoma

A remoção de proteínas mal dobradas na célula é regulada principalmente pelo sistema ubiquitina-proteassoma celular, em que a proteína é primeiro reconhecida e marcada pela ubiquitina, uma pequena proteína reguladora, e traficada para o proteassoma, um complexo multiproteico, para hidrólise e depuração.

A atividade prejudicada do sistema ubiquitina-proteossomo, uma ocorrência comum em doenças neurodegenerativas, pode fazer com que proteínas mal dobradas se acumulem dentro das células, formando agregados de proteínas insolúveis com efeitos citotóxicos.

Para visualizar e quantificar a agregação de proteínas in vitro, obtenha uma suspensão de células de mamíferos transduzidas - expressando uma proteína mutante marcada com fluorescência que adota uma conformação mal dobrada com resíduos hidrofóbicos expostos - em meios adequados.

Pipete concentrações crescentes de um inibidor de proteassoma para os poços de uma placa preta de vários poços para minimizar a fluorescência de fundo durante a imagem. Semeie a suspensão de células de mamíferos nos poços. Incube para permitir que as células adiram ao fundo da placa e proliferem.

Uma vez dentro, o inibidor do proteassoma se liga aos sítios proteolíticos do proteassoma e bloqueia sua atividade, fazendo com que as proteínas mutantes expressas se acumulem, que então interagem por meio de seus resíduos hidrofóbicos expostos e formam agregados citoplasmáticos, levando à morte celular.

Adicione um corante fluorescente de ligação ao DNA para manchar os núcleos das células. Imagem da placa. Os agregados de proteínas mutantes fluorescentes parecem dispersos dentro do citoplasma não corado.

Os poços contendo concentrações mais altas de inibidores de proteassoma exibem maior proporção de números de agregados de proteínas para contagem de células do que os poços com concentrações mais baixas de inibidores de proteassoma.

Para a transferência de compostos, em uma placa de polipropileno de armazenamento de 384 poços, adicione diluições seriadas de compostos pela série de diluição padrão de 1 a 3. Em seguida, usando um manipulador de líquidos equipado com uma cabeça capilar de 384, distribua 0,25 microlitros de inibidores de proteassoma em placas de ensaio pretas vazias de fundo plano de 384 poços. Em seguida, semeie 1,5 x 10⁴ células nessas placas. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Antes de obter imagens da linhagem celular tratada com inibidores de proteassoma, adicione 10 microlitros de DMEM pré-aquecido com solução de coloração e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Após a coloração, inicie o software operacional do microscópio automatizado selecionando a guia "Microscópio". Primeiro, selecione a guia "Configuração" e, em seguida, selecione a objetiva 20X e o tipo de placa correto.

Para permitir o foco adequado com diferentes tipos de placas, certifique-se de que o "Colar" esteja definido com o valor correto na objetiva.

Em seguida, selecione 'Exposição 1', defina a altura do foco para '0 micrômetros' e, em seguida, selecione "Foco". Uma vez focado, exponha a Câmera 1.

Para otimizar o plano de exposição, ajuste a altura do foco e clique em "Assumir altura". Altere os tempos de exposição na potência do laser para uma intensidade máxima de pixels de aproximadamente 3.000 e salve os parâmetros de exposição.

Selecione a guia "Definição do experimento". Crie um layout e um sublayout. Em seguida, arraste e solte o layout relevante, a exposição, a imagem de referência, o arquivo de corte inclinado e o sublayout. Em seguida, salve o experimento.

Por fim, selecione a guia "Experimento automático" e adquira imagens. Para imagens de 2 canais, primeiro selecione o algoritmo do software para segmentar os objetos primários, como núcleos, citosol e agregados.