Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence

Un protocole fournit un modèle simple pour évaluer l’intégrité synaptique d’une manière dépendante de l’âge. Ainsi, nous pouvons étudier les maladies neurodégénératives dans les tissus qui sont utilisables à la fois à l’analyse structurelle et fonctionnelle. Cette technique facilite la préservation des tissus neuronaux et musculaires des jonctions neuromusculaires longitudinales dorsales du muscle.

Étudier en profondeur la fonction synaptique au fil du temps et les tissus qui sont difficiles à travailler avec. Cette méthode peut être appliquée à l’étude des maladies neurodégénératives, y compris la SLA, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer. Avant de commencer, la dissection a coupé environ 10 millimètres de la pointe d’une pipette de 200 microlitres.

Après l’administration de l’anesthésie, jouer six à 10 mouches dans une boîte de Six centimètres Petri contenant 70% d’éthanol et utiliser un pinceau pour siroter doucement fusionner chaque mouche. Après une à deux minutes, utiliser des forceps pour transférer une mouche par les jambes ou les ailes à un plat de dissection enduit d’élastomer en silicone contenant de sept à 10 millilitres de PBS sous un microscope disséquant. Avec la mouche immergée dans le PBS, utilisez des forceps de recherche Dumont émoussés numéro cinq pour enlever soigneusement les ailes et utiliser des ciseaux de dissection de ressort à bord droit pour faire une petite incision dans le côté ventral de la cuticule pour enlever les jambes.

En tenant les ciseaux de dissection dans une main et les forceps contondants dans l’autre, placez le côté ventral de mouche vers le haut et maintenez le spécimen en place avec les forceps, enlevez la tête et l’abdomen avec les ciseaux. Utilisez une pipette de 200 microlitres réglée sur 40 microlitres et la pointe de pipette modifiée pour recueillir les thoraciques et placer les échantillons de tissus isolés dans un tube dûment étiqueté contenant 900 microlitres de PBS et 150 microlitres de formaldéhyde à 32 %. Après 30 minutes à température ambiante, utiliser une pipette Pasteur pour enlever le fixatif et rincer les plis trois fois avec 1,5 millilitres de PBS par lavage.

Avant de commencer les bisections Don cryo gants de protection et des lunettes de sécurité et remplir un flacon de tournée avec de l’azote liquide. Utilisez un disjoncteur à lame pour saisir une lame de plume à un angle et plier la lame pour détacher un petit morceau. Utilisez le disjoncteur à lame pour verrouiller la lame en position et utilisez une pipette Pasteur en verre pour retirer tous les PBS des tubes de l’échantillon.

Utilisez des pinces cryogéniques pour plonger les tubes dans le flacon d’azote liquide. Après 10 secondes, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter environ 300 microlitres de PBS glacé à chaque tube sur la glace, et placez un côté ventral axe pauvre vers le haut dans un plat de dissection enduit d’élastomer de silicone de 10 centimètres contenant du PBS glacé. Utilisez une paire terne de forceps pour positionner le thorax et pour trouver la paire de forceps, pour enlever une partie des ganglions thoraciques pour exposer la ligne médiane du thorax.

En utilisant la ligne médiane du thorax comme guide, utilisez le jeu pour faire une coupe peu profonde à travers un tiers du thorax et utiliser les forceps contondants pour positionner le thorax à un angle de 45 degrés. Utilisez la lame pour couper directement la ligne médiane du thorax pour obtenir deux hémithoraces et pour faire soigneusement une ou deux coupures pour enlever l’excès de tissu sans endommager les muscles longitudinals dorsal. Placez ensuite les échantillons de tissu musculaire dans un tube de PBS dûment étiqueté.

Lorsque tous les échantillons de thorax ont été coupés en deux perméabilize les tissus en bloquant tampon pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, vortex fraîchement préparé solution de tache structurelle et ajouter 150 microlitres de la tache à chaque échantillon pour une incubation de deux heures sur un rotateur à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir souillé laver les échantillons dans PBST, et placer cinq étiquettes de renforcement empilées et coupées en deux de 15 millimètres l’un de l’autre sur une lame de microscope en verre.

Utilisez une pointe de micro pipette modifiée pour transférer les Thoraces sur chaque glissière et utilisez un lingette de laboratoire pour éliminer tout excès de PBST. Utilisez des forceps pour organiser les échantillons de sorte que les Thoraces sont face côté muscle vers le haut. Lorsque les échantillons sont correctement orientés, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour appliquer 70 microlitres de milieu de montage à chaque glissière et couvrir chaque glissière d’un glissement de couvercle.

Ensuite, utilisez du vernis à ongles pour enrober généreusement les bords extérieurs des feuillets de couverture pour obtenir un joint complet autour de chaque tissu. Évaluer l’intégrité synaptique. Les jonctions neuromusculaires peuvent être tachées de peroxidase de raifort et d’étain Floe Les motoneurones dans la protéine liant le goudron de 43 moutons kilodaltons ont peu ou pas de taches de peroxyde de raifort au jour 21, tandis que la protéine de type sauvage reste intacte.

Aucune différence visible dans la coloration musculaire n’est observée. En plus de la coloration structurale dorsal l’étiquetage longitudinal de jonction neuromusculaire de muscle peut également fournir une évaluation de l’intégrité synaptique avec des marqueurs pré synaptiques et post-synaptiques. Notez que le gel par flash d’azote liquide facilite une bisection réussie car les tissus congelés non flash sont plus sensibles aux dommages pendant la dissection.

Suivant cette procédure, les échantillons de conserve peuvent être analysés par microscopie confocale pour mesurer un aspect spécifique de la structure synaptique.