Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Os microscópios de florescência de folha de luz baseados em câmara de amostra são projetados para alto conteúdo em vez de alto rendimento. Os ensaios de imagem ao vivo devem, portanto, ser realizados sequencialmente e, portanto, menos afetados pela variação do ambiente. Nosso suporte de teia de aranha permite o empilhamento e a geração simultânea de imagens de vários embriões, eliminando a variação do ambiente e aumentando o rendimento.

A montagem de embriões no suporte da teia de aranha requer uma certa sutileza. Um vídeo explicativo é ideal para ilustrar a sequência dos muitos gestos curtos de conduta. Para calibração da câmara de amostra do microscópio de fluorescência de folha de luz.

Primeiro, reliquefaça uma alíquota de agarose em um misturador aquecedor de bloco seco a 80 graus Celsius. Deixe a agarose derretida esfriar a 35 graus Celsius e transfira 50 microlitros da agarose para um tubo de reação de 1,5 mililitro. Misture 0,5 microlitros de solução de microesfera fluorescente com a agarose a 1.400 rotações por minuto por um minuto e preencha o orifício do suporte da teia de aranha com 10 microlitros da mistura de solução de microesfera fluorescente de agarose.

Aspire o máximo de agarose possível até que reste apenas uma fina película de agarose e deixe a agarose solidificar por 30 a 60 segundos. Encha a câmara de amostra com água da torneira autoclavada e insira lentamente o suporte da teia de aranha na câmara de amostra. Mova o orifício ranhurado na frente da lente de detecção e gire o suporte para uma posição de 45 graus em relação aos eixos de iluminação e detecção.

O suporte da teia de aranha não deve ser visível no canal de luz de transmissão. Mude para o canal de fluorescência apropriado e ajuste a potência do laser e o tempo de exposição, para que as microesferas fluorescentes forneçam um sinal adequado. Especifique um volume de visão que cubra completamente o filme de agarose agora orientado transversalmente e calcule a resolução axial máxima possível para a respectiva combinação de iluminação e lente de detecção para definir o espaçamento Z.

Em seguida, registre uma pilha de teste tridimensional Z das microesferas fluorescentes e compare as projeções máximas X, Y e Z com o gráfico de calibração. Se as microesferas parecerem embaçadas, difusas e/ou distorcidas. Ajuste as posições da iluminação e/ou das lentes de detecção.

Para a descorionação de embriões, adicione oito mililitros de água da torneira autoclavada nos poços A1, A2, A3 e B3 de uma placa de seis poços por linha. Em seguida, adicione sete mililitros de água da torneira autoclavada e um mililitro de solução de hipoclorito de sódio nos poços B1 e B2. Posicione a primeira placa sob um microscópio estéreo e insira o primeiro embrião contendo filtro de células no poço A1.

Lave os embriões sob agitação suave por 30 a 60 segundos, antes de mover o filtro para o poço B1. Agite a placa vigorosamente por 30 segundos, antes de transferir o filtro para o poço A2. Lave os embriões por um minuto sob agitação suave e mova o filtro para o poço B2 para agitar vigorosamente até que a maioria dos embriões esteja completamente descorionada.

Em seguida, transfira o filtro para o poço A3 por um minuto de lavagem suave, antes de armazenar o coador de embriões descorionados no poço B3 até que os embriões de outras linhagens tenham sido tratados conforme demonstrado. Para montar os embriões no suporte da teia de aranha, reliquefaça outra alíquota de agarose conforme demonstrado. Quando a agarose esfriar, coloque o suporte da teia de aranha sob o microscópio estéreo e adicione 10 microlitros de agarose no orifício com fenda.

Use a ponta da pipeta para espalhar a agarose sobre o orifício com fenda, antes de aspirar o máximo de agarose possível até que reste apenas uma fina película de agarose. Quando a agarose estiver solidificada, use um pincel para escolher e transferir cuidadosamente os embriões para o filme de agarose. Organize-os ao longo do eixo longo do orifício ranhurado com seus eixos ântero-posteriores alinhados com o eixo longo do orifício ranhurado.

Para estabilizar os embriões, pipete cuidadosamente de um a dois microlitros de agarose no espaço entre os embriões e o filme de agarose. Quando a agarose estiver solidificada, insira lentamente o suporte da teia de aranha com os embriões montados na câmara de amostra cheia de tampão de imagem. Para obter imagens dos embriões, confirme se o suporte da teia de aranha está em uma posição de 45 graus em relação aos eixos de iluminação e detecção e no canal de luz de transmissão, mova o embrião para o centro do campo de visão.

O suporte da teia de aranha não deve ser visível. Em seguida, mova o embrião com o estágio de microtradução em Z até que o plano médio do embrião se sobreponha ao plano focal e o contorno pareça nítido. Sem mudar para o canal de fluorescência, mova o embrião 250 mícrons em ambas as direções para especificar o volume de visão.

Se for necessária a aquisição de imagens em várias direções, gire o embrião adequadamente, coloque o embrião em foco e especifique o volume de visão conforme demonstrado. Em seguida, repita este procedimento para todos os outros embriões montados. Quando o volume de visualização tiver sido especificado para todos os embriões, defina o canal de fluorescência e os parâmetros de lapso de tempo e inicie o processo de imagem.

Para ensaios que duram vários dias, considere cobrir a abertura da câmara de amostra pelo menos parcialmente para reduzir a evaporação. Quando o ensaio de imagem terminar, remova cuidadosamente o suporte da teia de aranha da câmara de amostra e use um pincel pequeno para separar os embriões do filme de agarose e colocá-los em uma lâmina de microscópio apropriadamente marcada. Coloque a lâmina em um recipiente de recuperação para incubação nas condições de criação padrão apropriadas.

À medida que o ponto de eclosão se aproxima, verifique as placas de recuperação com frequência e transfira todas as larvas eclodidas para poços individuais de uma placa de 24 poços. Encher os alvéolos até meio com o meio de crescimento adequado e, em seguida, incubar as larvas nas condições de criação padrão adequadas. Quando os indivíduos observados atingirem a idade adulta, forneça parceiros de acasalamento adequados e verifique se há progênie após vários dias.

Neste vídeo, a dinâmica do sinal fluorescente de três embriões derivados de diferentes linhagens transgênicas de Drosophila durante um período de cerca de um dia pode ser observada. Um padrão de fluorescência semelhante era esperado, uma vez que todas as linhas expressavam EGFP localizado nuclear sob o controle de promotores presumivelmente onipresentes e constituintemente ativos. Os resultados comparativos de imagens ao vivo, no entanto, revelaram fortes diferenças espaço-temporais nos padrões de expressão que não eram efeitos secundários devido à variância ambiental.

Nesta análise de três embriões de Tribolium carregando o mesmo transgene baseado em piggyback. Resultados comparativos de imagens ao vivo do processo de fechamento da janela serosa durante a gastrulação sugerem que a segunda sub-linha fornece um sinal geral notavelmente mais forte do que as outras duas sub-linhas. Como esses dados indicam, o contexto genômico também pode ter uma forte influência no nível de expressão de transgenes em Tribolium.

Nossa abordagem é adequada para analisar fenótipos knockdown e knockout, pois permite que embriões de controle do tipo selvagem sejam visualizados simultaneamente. Nosso protocolo também pode ser usado para comparar a morfogênese de duas ou mais espécies de insetos. E, assim, obter insights mais profundos sobre a evolução do desenvolvimento.