Name: Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprenda a transferir amostras criogênicas para espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico, preservando a viabilidade celular em células de mamíferos. Este protocolo evita acúmulo de umidade e garante integridade da amostra.

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Este trabalho foi apoiado por doações do Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], a National Science Foundation [1751174]; os Institutos Nacionais de Saúde [NS-111236], a Fundação Welch [1-1923-20170325]; a Fundação Lupe Murchison, a Fundação Ted Nash Long Life e a Kinship Foundation (Searle Scholars Program) para k.K.F.

1. Cultura e crioproteção de células mamíferas
<ol><li>Cultura e colheita de células de mamíferos<ol>
<li>Descongele uma alíquota de células renais embrionárias humanas congeladas (HEK 293).</li>
		<li>Cultura HEK 293 células em mídia de crescimento (por exemplo, DMEM com soro bovino fetal de 10% e 1% Pen-Strep) a 37 °C com 5% de CO2 em placas de 100 mm para duas a três passagens (7-10 dias).</li>
		<li>Divida as células e a cultura em uma placa de 150 mm até que as células atinjam 90-95% de confluência. NOTA: Uma placa de 150 mm a > confluência de 90% será suficiente para encher dois rotores de safira com diâmetro de 3,2 mm.</li>
		<li>Células de colheita usando 4 mL de trippsina (ver Tabela de Materiais) e 10 mL de mídia. Transfira a suspensão para um concânico e centrífuga de 15 mL estéril a 673 x g (1000 rpm) por 5 min a temperatura ambiente. Remova o supernatante.</li>
		<li>Lave a pelota celular com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crioproteção das células<ol>
<li>Colete uma pelota de célula de 50 μL em um tubo de microcentrifuuagem. Prepare uma mistura de 50 μL de PBS e 18 μL de glicerol em um tubo separado.</li>
		<li>Misture suavemente a pelota de célula de 50 μL com 68 μL de mistura glicerol-PBS adicionando a mistura glicerol-PBS ao topo da pelota e reutilizando a pelota batendo suavemente na lateral do tubo até que não restem aglomerados. NOTA: A tubulação suave também pode ser usada para resususpensar a célula, no entanto, certifique-se de que a integridade celular não esteja comprometida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Criopreservação de células mamíferas em um rotor de RMN
<ol><li>Transferência de células para um rotor de safira de 3,2 mm.<ol>
<li>Para fazer um funil, corte uma ponta de pipeta de 200 μL e insira a extremidade estreita da ponta de pipeta cortada no rotor de 3,2 mm.</li>
		<li>Transfira as células para o funil sentado no rotor. Coloque o rotor junto com o funil em um tubo de microcentrifuuge e pelota as células na parte inferior do rotor por centrifugação a 673 x g para 2-3 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remova o supernatante e qualquer amostra em excesso do rotor. Repita estes dois passos até que o rotor esteja totalmente embalado com as células. NOTA: Opcionalmente, determine a viabilidade celular da amostra antes de congelar. Resuspend 10 μL da pelota de célula em excesso de pelotas em 100 μL de DMEM livre de FBS. Misture 10 μL da suspensão com solução azul trypan de 0,4% e avalie imediatamente a viabilidade usando um contador automático de células. Use apenas mídia livre FBS para diluir células à medida que o soro interfere com a coloração azul trypan.</li>
		<li>Sele o rotor com um plugue de silício usando uma ferramenta de embalagem comercialmente disponível.</li>
		<li>Feche o rotor com uma ponta de acionamento de cerâmica pressionando-o verticalmente para baixo. Evite tocar nas delicadas aletas na lateral da ponta da unidade.</li>
		<li>Marque metade da borda inferior do rotor de safira com um marcador permanente prateado e a outra metade da borda inferior do rotor com um marcador permanente preto para permitir o monitoramento preciso da fiação do rotor dentro do espectrômetro. NOTA: As imperfeições na marcação do rotor evitarão uma contagem precisa da frequência giratória, resultando na falha em alcançar uma fiação estável. Porque os marcadores não escreverão em um rotor congelado e o aquecimento do rotor compromete a integridade da amostra, marcar o rotor antes de congelar é um passo crítico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criopreservação de células dentro de um rotor de safira de 3,2 mm.<ol>
<li>Coloque uma almofada feita por um pedaço de tecido ou toalha de papel sob a tampa e na parte inferior do frasco criogênico (ver Tabela de Materiais). NOTA: O papel de tecido protege a marcação do rotor contra danos incorridos batendo contra os lados dos frascos criogênicos.</li>
		<li>Coloque o rotor de safira de 3,2 mm no frasco criogênico acolchoado com o papel de tecido com extremidade marcada voltada para o fundo do frasco criogênico.</li>
		<li>Congele lentamente o rotor colocando o frasco criogênico no recipiente de resfriamento de taxa controlada (-1 °C/min) e coloque o recipiente no congelador de -80 °C por um mínimo de 3h.</li>
		<li>Transfira o frasco criogênico contendo o rotor congelado para o armazenamento líquido de nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transferência criogênica de uma amostra congelada para o espectrômetro NMR
<ol><li>Transporte a amostra congelada para a instalação da RMN.<ol>
<li>Transfira o frasco criogênico contendo o rotor congelado para uma pequena de guerra cheia de nitrogênio líquido para transporte para a instalação da RMN.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência de rotor congelado para o banho de nitrogênio líquido.<ol>
<li>Encha uma espuma de boca larga seca e isolada termicamente com 500 mL – 1 L de nitrogênio líquido.</li>
		<li>Transfira o rotor do frasco criogênico para a espuma de espuma da boca larga recheada com nitrogênio líquido.<ol>
<li>Pegue o frasco criogênico da transferência de guerra na mão e segure-o logo acima da superfície do nitrogênio líquido para protegê-lo da atmosfera.</li>
			<li>Enquanto segura o frasco criogênico com a boca apontando ligeiramente para baixo, desaparafusar a tampa e deixar o rotor deslizar para o banho de nitrogênio líquido. NOTA: Uma vez que a tampa esteja desparafusada, o rotor deve cair do frasco criogênico para o banho de nitrogênio líquido rapidamente (menos de 1 segundo) para evitar que a condensação seja coletado no rotor. A evaporação do nitrogênio líquido forma uma "nuvem de nitrogênio" na de guerra da espuma da boca larga e previne a condensação do rotor antes de ser submerso no nitrogênio líquido. A maior exposição do rotor ao ar pode levar à condensação da umidade nas paredes do rotor que se re condensarão no gelo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência criogênica de rotor para receptor de amostras NMR.<ol>
<li>Prechill um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL submergindo-o no banho de nitrogênio líquido. Não feche o tubo. NOTA: Inspecione o rotor antes de transferir para o tubo de microcentrifuuagem. Usando pinças, segure o rotor logo abaixo da superfície do nitrogênio líquido e verifique se as marcas do rotor estão intactas, que nenhum depósito de gelo se formou em suas paredes e que a ponta da unidade está intacta. Depósitos de cristal de gelo nas paredes do rotor aparecem como pó branco. Tenha cuidado para sempre segurar o rotor pelo corpo e não pela ponta da unidade. Não arranhe a marcação do rotor com as pontas da pinça.</li>
		<li>Sob a superfície do banho de nitrogênio líquido, use pinças para transferir o rotor para o tubo de microcentrifuuge com a ponta de acionamento voltada para a parte inferior do tubo de microcentrifuuge e as marcas voltadas para a abertura do tubo. NOTA: Sempre seque pinças antes de submergir em nitrogênio líquido ou tocar no rotor.</li>
		<li>Usando pinças, segure o tubo contendo o rotor sob nitrogênio líquido pelo pescoço.</li>
		<li>Com um segundo par de pinças na mão, prepare-se para submergir o apanhador de amostras de NMR no banho de nitrogênio líquido e segurá-lo para que ele esteja inclinado a um ângulo agudo em relação ao tubo de microcentrifuuge. NOTA: Minimize o tempo em que o apanhador de amostras esteja em contato com o nitrogênio líquido para evitar o congelamento do anel O. Se o anel O congelar, será muito difícil inserir o apanhador no espectrômetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência de rotor criogênico do apanhador de amostras NMR para espectrômetro NMR NOTA: Esta etapa requer duas pessoas, uma para operar a criocabinet e outra para transferir a amostra do nitrogênio líquido para a sonda.<ol>
<li>Coloque o criocabinet no modo de ejeção pressionando 'EJETAR' no gabinete. NOTA: O modo de ejeção elimina o fluxo de gás nitrogênio seco e frio em alta pressão da sonda para a atmosfera, a fim de evitar a entrada de umidade atmosférica.</li>
		<li>Transfira o rotor para o apanhador de amostras NMR.<ol>
<li>Insira a extremidade aberta do apanhador de amostras de NMR no tubo de microcentrifuuuagem enquanto ainda estiver sob a superfície do nitrogênio líquido.</li>
			<li>Levante o tubo de microcentrifuge e o apanhador de amostras de NMR para permitir que o rotor caia no receptor de amostras. Agite o apanhador de amostras de NMR e o tubo de microcentrifuuge no caso de o rotor ficar preso na borda do receptor de amostras.</li>
			<li>Deixe o tubo de microcentrifuuge vazio em cima do apanhador de amostras NMR para proteger o rotor do ar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova o outro apanhador de amostras NMR vazio da sonda e coloque-o no chão.</li>
		<li>Transfira o apanhador de amostras de NMR contendo o rotor para a mão livre, remova o tubo de microcentrifuuagem e insira-o imediatamente na sonda. NOTA: Se o anel O congelar, será difícil apertar o apanhador de amostras. Continue aplicando força até que ele deslize no lugar.</li>
		<li>Sinalize a pessoa que opera o cryocabinet para 'STOP EJECT' e 'INSERT'. NOTA: O modo de inserção guia o rotor do receptor de amostra para dentro da sonda.</li>
		<li>Gire a amostra para a taxa de fiação desejada (por exemplo, 12 kHz) ajustando a pressão de fluxo de rolamento e condução controlada pela criocabinet. (por exemplo, aumente imediatamente o gás de rolamento para ~200 mBar e o gás de acionamento para 10 mBar. Uma vez que a amostra gire, aumente o gás de rolamento para 1000 mBar e leve o gás para 200 mBar. À medida que a fiação se estabiliza, aumente o rolamento para 2400 mBar e, em seguida, aumente o gás de condução de 200 mBar para 1700 mBar ao longo de vários minutos. O gás de resfriamento VT é constante em ~1070 L/h.) NOTA: Ao levantar o tubo de microcentrifuuge e o apanhador de amostras de NMR do banho de nitrogênio líquido, certifique-se de que o tubo de microcentrífuga tenha nitrogênio líquido suficiente dentro dele para cercar o rotor. Minimize o tempo entre transferir o rotor para o apanhador de amostras de RMN e inserir o apanhador de amostras de RMN no espectrômetro. Todas as etapas do 3.4 devem ser concluídas dentro dos 30 s.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Remoção criogênica da amostra do espectrômetro NMR
<ol><li>Preparação do banho de nitrogênio líquido e do frasco criogênico<ol>
<li>Despeje 500 mL - 1 L de nitrogênio líquido na espuma de espuma da boca larga e coloque o banho sob o espectrômetro.</li>
		<li>Pré-esfrie o frasco criogênico. Submergir o frasco criogênico vazio contendo um pedaço de papel de tecido no banho de nitrogênio líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência criogênica de rotor da sonda para o frasco criogênico<ol>
<li>Reduza a taxa de rotação para 0 kHz, reduzindo o fluxo de fluxo de vapor e rolamento do gás e ejete o rotor mudando para o modo de ejeção.</li>
		<li>Mantenha o modo de ejeção ligado, remova o apanhador de amostras da sonda, solte o rotor diretamente na dewar da espuma da boca larga contendo nitrogênio líquido.</li>
		<li>Usando pinças pré-refrigeradas, transfira o rotor para um frasco criogênico pré-refrigerado sob a superfície do nitrogênio líquido.</li>
		<li>Tampe o frasco criogênico. Prechill a tampa de frasco criogênico mergulhando-o em nitrogênio líquido. Remova o frasco criogênico contendo o rotor e nitrogênio líquido do banho e tampa o tubo com tampa pré-filhada. Não aperte a tampa para que o nitrogênio vaporizador possa ser liberado com segurança.</li>
		<li>Submergir o frasco criogênico em nitrogênio líquido. A amostra pode ser transferida para armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo ou desembalada imediatamente para análise suplementar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Desempacotar as medidas do rotor e da viabilidade
<ol><li>Desempacotamento do rotor e viabilidade de medição<ol>
<li>Mídia livre de soro pré-quente (DMEM) ou PBS a 37 °C.</li>
		<li>Remova o rotor do nitrogênio líquido. Remova a ponta da unidade e o plugue de silicone. NOTA: Safira é um excelente condutor de calor. Evite tocar no rotor com os dedos, pois a transferência de calor pode causar eventos locais de congelamento que comprometem a viabilidade celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medindo a viabilidade<ol>
<li>Adicione 20 μL de mídia quente à pelota de célula congelada no rotor e células resusgasentas. Retire a suspensão com uma pipeta e misture a suspensão com 100 μL de mídia.</li>
		<li>Remova 10 μL de suspensão celular e misture com o mesmo volume de 0,4% de solução azul trypan (v/v). Incubar em temperatura ambiente por 30 a 1 min.</li>
		<li>Medir a viabilidade usando o contador automático de células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Schmidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+freezing+permits+cryoprotectant-free+EPR+doubled+electron-electron+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A transferência criogênica de amostras congeladas em um espectrômetro NMR é bem sucedida em preservar a viabilidade das células de mamíferos congelados através da aquisição de dados NMR. O sucesso dessa metodologia é demonstrado em medições de viabilidade pré e pós-MAS NMR. Esta abordagem é bem sucedida e generalizável para qualquer sistema onde flutuações de temperatura possam comprometer a integridade da amostra. O protocolo apresentado atualmente é realizado com a linha de células HEK 293. Como as condições de criopreservação para muitas linhas de células de mamíferos são muito semelhantes, é provável que as condições aqui relatadas sejam traduzíveis para outros sistemas celulares; no entanto, podem exigir maior otimização dos crioprotetores, volumes amostrais e taxas de congelamento para alcançar os mesmos resultados.
Essa metodologia pode ser melhorada desempacotando o rotor mais rápido pós-NMR. Esta etapa é atualmente sub ideal e sua execução afeta a viabilidade das células. Antes que as células possam ser resuspendidas em mídia, a ponta da unidade e o plugue de silício devem ser removidos do rotor. A amostra descongela de forma irregular quando o rotor é mantido durante a remoção da ponta da unidade e o plugue de silício de modo tão curto os tempos de manuseio do rotor resultam em maiores viabilidades. O desenvolvimento de suportes de rotor ou outras ferramentas para facilitar o descongelamento uniforme e a remoção rápida da ponta da unidade e o plugue de silício ajudaria a tornar a avaliação pós-NMR da viabilidade mais precisa.
A abordagem do carregamento de amostras criogênicas descrita neste artigo limita-se a sondas NMR que suportam a inserção e ejeção da amostra com a sonda no suporte do ímã NMR. Embora a inserção e a ejeção de amostras externas seja padrão para sistemas DNP comerciais, os testes personalizados nem sempre têm essa opção. Além disso, essa abordagem para o carregamento de amostras criogênicas pode exigir alguma modificação para sondas NMR construídas para serem compatíveis com rotores de tamanho diferente. Este protocolo foi otimizado para rotores de 3,2 mm e pode exigir modificação se o diâmetro externo do receptor de amostra exceder o diâmetro interno de um tubo de microcentrída (por exemplo, passo 3.4.2).
Com a aplicação de DNP ao MAS NMR, agora é possível detectar proteínas e outras biomoléculas em concentrações fisiológicas endógenas24,25,26. Isso abre a possibilidade de estudar biomoléculas em seus ambientes nativos. A manutenção da integridade celular e da viabilidade ao longo do experimento provavelmente será fundamental para conectar os resultados experimentais da espectroscopia a fenômenos biológicos. O congelamento descontrolado de amostras contendo proteínas purificadas ou lises celulares normalmente não compromete a qualidade da amostra7,27, embora existam algumas indicações de que a taxa de congelamento pode ser uma variável importante mesmo nos sistemas purificados28. No entanto, amostras de células mamíferas precisam ser congeladas a uma taxa controlada se preservar a intactidade e a viabilidade celular é importante para a interpretação. Aqui apresentamos um protocolo para congelar e transferir amostras congeladas de células mamíferas para um instrumento de NMR DNP MAS pré-resfriado que evita flutuações de temperatura potencialmente prejudiciais e suporta a medição em células viáveis.

A introdução da polarização nuclear dinâmica para espectroscopia de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico pode aumentar a sensibilidade do MAS NMR por várias ordens de magnitude. Isso permitiu a detecção de biomoléculas em ou perto de suas concentrações fisiológicas. O DNP pode e fornece a sensibilidade necessária para detectar uma proteína isototicamente rotulada em concentrações endógenas (~1 μM) em ambiente biológico complexo1. Como existem protocolos bem estabelecidos para introduzir moléculas isototicamente rotuladas em células mamíferas sem afetar sua viabilidade, isso abre a possibilidade de estudar biomoléculas enriquecidas isototicamente em seus níveis endógenos em seu ambiente nativo. Além disso, como os aprimoramentos do DNP são mais eficientes a temperaturas mais baixas2,3,4, as temperaturas experimentais para DNP MAS NMR se alinham perfeitamente com as necessárias para o armazenamento a longo prazo de células de mamíferos viáveis5. No entanto, o método convencional de transferência de uma amostra para um espectrômetro DNP MAS NMR submete-a a taxas de flutuação de temperatura que rompem células de mamíferos.
Os experimentos de NMR mas exigem que a amostra seja girada sobre o ângulo mágico em frequências iguais ou maiores do que a magnitude da interação anisotrópica para que ela seja mediada a zero, tipicamente com pelo menos 4 kHz e muitas vezes muito maior6,7,8,9. As amostras são, portanto, embaladas em rotores que têm uma ponta afim que é usada para conduzir a rotação do rotor por um fluxo de gás e têm uma marca na outra extremidade para que a frequência de rotação possa ser monitorada por um tacômetro. A transferência de amostras para a maioria dos instrumentos MAS NMR é realizada injetando o rotor do exterior do instrumento no estator no final da sonda NMR com um fluxo de ar seco ou gás nitrogênio. Depois que o rotor atinge o estator, que segura o rotor no ângulo mágico, a rotação da amostra é impulsionada por um mecanismo de turbina de ar. Fluxos separados de suporte a gás, impulsionem e controlem a temperatura do rotor. Inserir um rotor no espectrômetro NMR e alcançar o giro MAS estável requer pontas de acionamento finamente usinadas e controle rigoroso da temperatura e pressão dos fluxos separados de gás. Apesar dessas demandas técnicas, a inserção e a obtenção de MAS estável são em grande parte automatizadas para testes comerciais de NMR MAS para aplicações de temperatura ambiente.
No entanto, a situação é mais complicada para aplicações de baixa temperatura. Amostras para aplicações de baixa temperatura são tipicamente inseridas no espectrômetro à temperatura ambiente e congeladas no estator. No primeiro minuto, a temperatura da amostra diminui rapidamente (> −100 °C/min) e a temperatura do sistema requer vários minutos para se equilibrar. Devido à interação entre temperatura e pressão, a inserção e a aproximação do MAS desejado são frequentemente manuseadas manualmente para aplicações de baixa temperatura. Apesar da exigência de intervenção manual, o congelamento do rotor dentro do instrumento é benéfico porque minimiza a introdução de água e condensação na sonda, o que é fundamental para o sucesso da fiação. Não só a condensação e o acúmulo de gelo das linhas de gás do bloco de umidade ambiente, condensação ou geada no próprio rotor podem evitar mecanicamente a MAS. Assim, as amostras para NMR mas de baixa temperatura são tipicamente congeladas dentro do instrumento a taxas que excedem -100 °C/min.
As células mamíferas podem manter sua integridade através de um ciclo de congelamento se o resfriamento for lento5,10,11,12, a uma taxa igual ou mais lenta do que 1 °C/min. Alternativamente, as células também mantêm sua integridade se a taxa de resfriamento for ultrarrápida13,14,15, a uma taxa mais rápida do que 104 °C/min. Taxas intermediárias a esses dois extremos rompem e matam células mamíferas devido à formação de cristais de gelo dentro e fora das células, mesmo na presença de agentes crioprotetores16. As taxas de resfriamento da amostra para um rotor de temperatura ambiente dentro de uma sonda pré-resfriada caem entre esses dois extremos, para estudar células de mamíferos intactas preservadas criogenicamente preservadas, as amostras devem ser congeladas antes de serem transferidas para o instrumento e transferidas para o instrumento sem flutuações de temperatura que possam danificar a amostra ou o acúmulo de geada no rotor que poderia impedir que o rotor girasse. O protocolo descreve um método de inserção de rotor pré-resfriado e sem geada em um sistema de NMR mas criogênico para o estudo de amostras de células mamárias intactas preservadas criogenicamente. A transferência de amostra criogênica descrita aqui foi desenvolvida para caracterização de RMN de células intactas viáveis. No entanto, é aplicável a qualquer sistema onde flutuações de temperatura possam comprometer a integridade da amostra. Isso inclui qualquer variedade de sistemas complexos, como o congelamento de reações saciadas para caracterização química e estrutural dos intermediários de reação preso17,18, enzima19,20 ou dobramento deproteínas 21,22.

<table><tbody><tr><td>0,4% Mancha azul tripano</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 100 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 150 mm</td><td>Nunc</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de safira de 3,2 mm</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>45 &deg; pinça angular</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-859</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td></td><td></td>C010P005</tr><tr><td>Marcador preto e prata</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cap ferramenta de remoção</td><td>Bruker</td><td>HZ16913</td><td></td></tr><tr><td>água de grau de cultura de células</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de cerâmica</td><td>Cortecnet</td><td>HZ12372</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning / Biocision</td><td>UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de câmara de contagem de células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10288</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos criogênicos</td><td>Nalgene</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>d8-glicerol</td><td>Aldrich</td><td>447498</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério, 99,8% átomo D</td><td>Aldrich</td><td>756822-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Sistema DNP NMR com giroscópio de frequência correspondente</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam dewar</td><td>Spearlab</td><td>FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimwipes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de embalagem</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS VWR em pó</td><td></td><td>VWRRV0780</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>de vaso padrão</tr> <tr><td>protonada PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>Tryp-L</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr></tbody></table>

amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

A polarização nuclear dinâmica (DNP) pode aumentar drasticamente a sensibilidade da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) de ângulo mágico. Esses ganhos de sensibilidade aumentam à medida que as temperaturas diminuem e são grandes o suficiente para permitir o estudo de moléculas em concentrações muito baixas nas temperaturas operacionais (~100 K) da maioria dos espectrômetros NMR equipados com DNP comerciais. Isso leva à possibilidade de biologia estrutural em células em células criopreservadas para macromoléculas em seus níveis endógenos em seus ambientes nativos. No entanto, as taxas de congelamento exigidas para a criopreservação celular são excedidas durante o manuseio típico da amostra para DNP MAS NMR e isso resulta em perda de integridade celular e viabilidade. Este artigo descreve um protocolo detalhado para a preparação e transferência criogênica de uma amostra congelada de células mamíferas em um espectrômetro MAS NMR.

A inserção criogênica de amostras pré-congeladas de células mamíferas no espectrômetro NMR suporta viabilidade durante todo o experimento NMR. Esquemas de transferência criogênica de uma amostra congelada em uma sonda NMR pré-resfriada é mostrado na Figura 1. A viabilidade celular e a inintegridade podem ser avaliadas usando uma variedade de métodos. Aqui usamos uma medida padrão baseada em corante da integridade da membrana, que se alinha bem com outros métodos23. Células intactas são impermeáveis ao azul trypan enquanto células com integridade de membrana comprometida são permeáveis. O número de células permeáveis e impermeáveis do trypan azul pode ser rapidamente avaliado usando um contador automatizado de células. Usando o protocolo descrito aqui, a permeabilidade azul trippan das células mamíferas após o MAS NMR (ou seja, no ponto 5.2.3) é semelhante à permeabilidade azul tripupan das células mamíferas antes de qualquer mudança de temperatura (ou seja, ponto 2.1.3). No entanto, se as células são congeladas lentamente, então aquecidas à temperatura ambiente antes da inserção (ou seja, seguindo o protocolo para o ponto 3 antes de aquecer o rotor à temperatura ambiente antes de inserir na sonda refrigerada), a viabilidade celular avaliada pelo azul trypan diminui para menos de 10% das células(Figura 2). Assim, o congelamento de células dentro do espectrômetro resulta na perda da integridade da membrana celular, enquanto a inserção criogênica de amostras congeladas de células mamíferas suporta a viabilidade celular durante todo o experimento de RMN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de transferência criogênica de uma amostra congelada em uma sonda NMR pré-resfriada. (A) Aproxime-se da superfície do nitrogênio líquido e desaparafusar o topo do frasco criogênico. (B) Deslize o rotor para o banho de nitrogênio líquido. (C) Submerse um tubo de microcentrífuga usando pinças e segure-o no lugar até esfriar completamente. (D) Insira o rotor no microcentrifuso com a ponta da unidade voltada para a parte inferior do tubo. Empurre, em vez de agarrar, com a pinça. (E) Segure o tubo de microcentrifuuge logo abaixo da superfície do banho de nitrogênio líquido e inspecione visualmente o rotor para garantir que ele esteja livre de geada e bem marcado. (F) Segure o apanhador de amostras em um ângulo acima da superfície. (G) Retire o apanhador de amostras e o tubo do nitrogênio líquido assim que o apanhador de amostras estiver dentro do tubo de microcentrifuuagem. (H) Agite o apanhador de amostras se o rotor estiver preso na borda. (I) Remova o apanhador de amostras vazio da sonda e coloque-o no chão. (J) Remova o tubo de microcentrifutura do receptor de amostras com o rotor dentro, insira, aperte o apanhador de amostras na sonda e pressione "INSERT" no console de controle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig02.jpg"> Figura 2: A inserção criogênica de uma amostra pré-congelada de células mamíferas resulta em medições de intactidade celular semelhantes às amostras de células mamíferas que nunca foram congeladas. A porcentagem de células impermeáveis azuis para amostras que nunca foram congeladas (por exemplo, passo 2.1.3) é semelhante à das células para amostras após MAS NMR (por exemplo, passo 5.2.3 com 12 kHz MAS). As células congeladas lentas (por exemplo, passo 3) que foram aquecidas à temperatura ambiente antes da inserção no instrumento NMR que havia sido pré-resfriado para 100 K tinham percentuais muito menores de células intactas após MAS NMR com MAS de 12 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentado aqui é um protocolo para transferência criogênica de amostras congeladas para a dinâmica polarização nuclear (DNP) sonda de ressonância magnética nuclear (MAS). O protocolo inclui instruções para armazenamento de rotores antes do experimento e direções para medições de viabilidade antes e depois do experimento.

Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

A sensibilidade da espectroscopia de RMN MAS assistida por DNP nos permite caracterizar proteínas dentro de células intactas em sua concentração endógena. Esta aplicação requer um manuseio cuidadoso da amostra. Algumas morfologias preservadas e células são viáveis quando são transferidas criogenicamente para o espectrômetro usando este protocolo.A introdução do rotor frio pode causar acúmulo de umidade e gelo, o que pode impedir mecanicamente a rotação da amostra. Esta demonstração guiará experimentos para realizar a transferência criogênica com confiança. Para começar, coloque uma almofada feita de um pedaço de lenço de papel ou toalha de papel sob a tampa e no fundo do frasco criogênico.Coloque o rotor de safira de 3,2 milímetros no frasco criogênico preenchido com o papel de seda, com a extremidade marcada voltada para o fundo do frasco. Congele lentamente o rotor colocando o frasco em um recipiente de resfriamento de taxa controlada e coloque o recipiente em um freezer a 80 graus Celsius por no mínimo três horas. Transferir o frasco para injetáveis criogénico que contém o rotor congelado para um pequeno frasco a vácuo cheio de azoto líquido.Use o frasco de vácuo para transportar a amostra para a instalação do espectrômetro. Encha um frasco de espuma de boca larga, seco termicamente isolado e com 500 mililitros a um litro de nitrogênio líquido. Retire o frasco criogênico do frasco de transferência e segure-o logo acima da superfície do nitrogênio líquido para protegê-lo da atmosfera.Enquanto segura o frasco criogênico com a boca do frasco apontando ligeiramente para baixo, desaperte a tampa e deixe o rotor deslizar para dentro do banho de nitrogênio líquido. Pré-resfrie um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro submergindo-o no nitrogênio líquido. Sob a superfície do banho de nitrogênio líquido, use uma pinça para transferir o rotor para o tubo da microcentrífuga com a ponta de acionamento voltada para o fundo do tubo e as marcações voltadas para a abertura.Use uma pinça para segurar o tubo que contém o rotor sob nitrogênio líquido pelo gargalo. Com uma segunda pinça, segure o coletor de amostras de RMN acima da superfície do nitrogênio líquido inclinado em um ângulo agudo em relação ao tubo da microcentrífuga. Para transferir o rotor do coletor de amostras de RMN para o espectrômetro de RMN, coloque o gabinete criogênico no modo de ejeção pressionando ejetar.Insira a extremidade aberta do coletor de amostras de RMN no tubo de microcentrífuga enquanto ainda estiver sob a superfície do nitrogênio líquido. Levante o tubo da microcentrífuga e o coletor de amostras de RMN para permitir que o rotor caia no coletor de amostras. Agite o coletor de amostras e o tubo se o rotor ficar preso no aro.Deixe o tubo de microcentrífuga vazio em cima do coletor de amostras de RMN para proteger o rotor do ar. Remova o outro coletor de amostras vazio da sonda e coloque-o no chão. Transfira o coletor de amostras de RMN contendo o rotor para a outra mão.Em seguida, remova o tubo de microcentrífuga e insira-o imediatamente na sonda. Sinalize à pessoa que opera o gabinete criogênico para pressionar, parar, ejetar e inserir. Gire a amostra para a taxa de rotação desejada ajustando o rolamento e a pressão do fluxo de acionamento.Despeje 500 mililitros a um litro de nitrogênio líquido em um frasco de espuma de boca larga e coloque o banho sob o espectrômetro. Mergulhe o frasco criogênico vazio contendo um pedaço de papel de seda no banho de nitrogênio líquido. Reduza a taxa de rotação para zero kilohertz diminuindo o fluxo de gás de acionamento e rolamento e ejete o rotor alternando para o modo de ejeção.Mantendo o modo de ejeção ligado, remova o coletor de amostras da sonda e solte o rotor diretamente no frasco de espuma de boca larga contendo nitrogênio líquido. Usando uma pinça pré-resfriada, transfira o rotor para o frasco criogênico pré-resfriado sob a superfície do nitrogênio líquido. Pré-resfrie a tampa do frasco criogênico mergulhando-a em nitrogênio líquido.Remova o frasco contendo o rotor e o nitrogênio líquido do banho e tampe o tubo com a tampa pré-resfriada. Submergir novamente o frasco criogênico em nitrogênio líquido. A amostra pode ser transferida para armazenamento de nitrogênio líquido de longo prazo ou desembalada imediatamente para análise posterior.A inserção criogênica de amostras pré-congeladas de células de mamíferos no espectrômetro de RMN suporta a viabilidade durante todo o experimento de RMN. Usando este protocolo, a permeabilidade ao azul de tripano das células de mamíferos após a RMN da MAS é semelhante à das células não expostas a nenhuma mudança de temperatura. Se as células forem congeladas lentamente e aquecidas à temperatura ambiente antes da inserção, a viabilidade celular diminui para menos de 10% Enquanto isso, a inserção criogênica de amostras congeladas de células de mamíferos apóia a viabilidade celular durante o experimento de RMN.Ao tentar fazer o protocolo, solicite assistência para pressionar ejetar e girar a amostra para que a amostra possa ser introduzida na sonda antes de aquecer, certificando-se de que nenhuma umidade seja introduzida na sonda, com a certeza de que o espectrômetro ficará frio por muitas semanas. Este protocolo é aplicável a qualquer sistema onde as flutuações de temperatura possam comprometer a integridade da amostra, como reações de congelamento ou caracterização de intermediários de reação aprisionados, enzimologia e dobramento de proteínas.

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JoVE Journal

Biology

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Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular (Vídeo) | JoVE Journal

Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

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