Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

A sensibilidade da espectroscopia de RMN MAS assistida por DNP nos permite caracterizar proteínas dentro de células intactas em sua concentração endógena. Esta aplicação requer um manuseio cuidadoso da amostra. Algumas morfologias preservadas e células são viáveis quando são transferidas criogenicamente para o espectrômetro usando este protocolo.

A introdução do rotor frio pode causar acúmulo de umidade e gelo, o que pode impedir mecanicamente a rotação da amostra. Esta demonstração guiará experimentos para realizar a transferência criogênica com confiança. Para começar, coloque uma almofada feita de um pedaço de lenço de papel ou toalha de papel sob a tampa e no fundo do frasco criogênico.

Coloque o rotor de safira de 3,2 milímetros no frasco criogênico preenchido com o papel de seda, com a extremidade marcada voltada para o fundo do frasco. Congele lentamente o rotor colocando o frasco em um recipiente de resfriamento de taxa controlada e coloque o recipiente em um freezer a 80 graus Celsius por no mínimo três horas. Transferir o frasco para injetáveis criogénico que contém o rotor congelado para um pequeno frasco a vácuo cheio de azoto líquido.

Use o frasco de vácuo para transportar a amostra para a instalação do espectrômetro. Encha um frasco de espuma de boca larga, seco termicamente isolado e com 500 mililitros a um litro de nitrogênio líquido. Retire o frasco criogênico do frasco de transferência e segure-o logo acima da superfície do nitrogênio líquido para protegê-lo da atmosfera.

Enquanto segura o frasco criogênico com a boca do frasco apontando ligeiramente para baixo, desaperte a tampa e deixe o rotor deslizar para dentro do banho de nitrogênio líquido. Pré-resfrie um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro submergindo-o no nitrogênio líquido. Sob a superfície do banho de nitrogênio líquido, use uma pinça para transferir o rotor para o tubo da microcentrífuga com a ponta de acionamento voltada para o fundo do tubo e as marcações voltadas para a abertura.

Use uma pinça para segurar o tubo que contém o rotor sob nitrogênio líquido pelo gargalo. Com uma segunda pinça, segure o coletor de amostras de RMN acima da superfície do nitrogênio líquido inclinado em um ângulo agudo em relação ao tubo da microcentrífuga. Para transferir o rotor do coletor de amostras de RMN para o espectrômetro de RMN, coloque o gabinete criogênico no modo de ejeção pressionando ejetar.

Insira a extremidade aberta do coletor de amostras de RMN no tubo de microcentrífuga enquanto ainda estiver sob a superfície do nitrogênio líquido. Levante o tubo da microcentrífuga e o coletor de amostras de RMN para permitir que o rotor caia no coletor de amostras. Agite o coletor de amostras e o tubo se o rotor ficar preso no aro.

Deixe o tubo de microcentrífuga vazio em cima do coletor de amostras de RMN para proteger o rotor do ar. Remova o outro coletor de amostras vazio da sonda e coloque-o no chão. Transfira o coletor de amostras de RMN contendo o rotor para a outra mão.

Em seguida, remova o tubo de microcentrífuga e insira-o imediatamente na sonda. Sinalize à pessoa que opera o gabinete criogênico para pressionar, parar, ejetar e inserir. Gire a amostra para a taxa de rotação desejada ajustando o rolamento e a pressão do fluxo de acionamento.

Despeje 500 mililitros a um litro de nitrogênio líquido em um frasco de espuma de boca larga e coloque o banho sob o espectrômetro. Mergulhe o frasco criogênico vazio contendo um pedaço de papel de seda no banho de nitrogênio líquido. Reduza a taxa de rotação para zero kilohertz diminuindo o fluxo de gás de acionamento e rolamento e ejete o rotor alternando para o modo de ejeção.

Mantendo o modo de ejeção ligado, remova o coletor de amostras da sonda e solte o rotor diretamente no frasco de espuma de boca larga contendo nitrogênio líquido. Usando uma pinça pré-resfriada, transfira o rotor para o frasco criogênico pré-resfriado sob a superfície do nitrogênio líquido. Pré-resfrie a tampa do frasco criogênico mergulhando-a em nitrogênio líquido.

Remova o frasco contendo o rotor e o nitrogênio líquido do banho e tampe o tubo com a tampa pré-resfriada. Submergir novamente o frasco criogênico em nitrogênio líquido. A amostra pode ser transferida para armazenamento de nitrogênio líquido de longo prazo ou desembalada imediatamente para análise posterior.

A inserção criogênica de amostras pré-congeladas de células de mamíferos no espectrômetro de RMN suporta a viabilidade durante todo o experimento de RMN. Usando este protocolo, a permeabilidade ao azul de tripano das células de mamíferos após a RMN da MAS é semelhante à das células não expostas a nenhuma mudança de temperatura. Se as células forem congeladas lentamente e aquecidas à temperatura ambiente antes da inserção, a viabilidade celular diminui para menos de 10% Enquanto isso, a inserção criogênica de amostras congeladas de células de mamíferos apóia a viabilidade celular durante o experimento de RMN.

Ao tentar fazer o protocolo, solicite assistência para pressionar ejetar e girar a amostra para que a amostra possa ser introduzida na sonda antes de aquecer, certificando-se de que nenhuma umidade seja introduzida na sonda, com a certeza de que o espectrômetro ficará frio por muitas semanas. Este protocolo é aplicável a qualquer sistema onde as flutuações de temperatura possam comprometer a integridade da amostra, como reações de congelamento ou caracterização de intermediários de reação aprisionados, enzimologia e dobramento de proteínas.