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DOI: 10.3791/57776-v
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
This article describes a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo. This approach allows for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells, specifically applied to SIV-infected CD4 + T cells isolated from rhesus macaques.
Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV+ T células isoladas de macacos rhesus.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das interações hospedeiro-patógeno, como quais são as características únicas das células produtivamente infectadas, quais cofatores de hospedeiro permitem que os vírus estabeleçam infecção produtiva e como direcionar essas células em intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece medidas quantitativas tanto para proteínas quanto para mRNA dentro de células únicas, e a maioria dos reagentes estão disponíveis comercialmente. Demonstrando o procedimento de triagem celular estará Matthew Creegan, um técnico sênior do núcleo de citometria de fluxo no laboratório do Doutor Michael Eller.
Para começar, em uma estação de trabalho de biologia molecular pré-PCR designada, prepare a mistura de ensaios combinando 96 ensaios de expressão genética em um tubo RNase, livre de DNase certificando-se de adicionar cada ensaio a uma concentração final de 180 nanomolar de primers dianteiros e invertidos. Adicione o tampão de suspensão de DNA para obter a diluição apropriada da mistura de ensaio. Para cada matriz de chip 96 por 96, pipeta seis microliters de cada ensaio em um poço designado de uma placa PCR de 96 poços, em seguida, selar a placa com um adesivo.
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