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Immunology and Infection
Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por v...
Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por v...
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Immunology and Infection
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JoVE Journal Immunology and Infection
Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Full Text
11,168 Views
13:13 min
September 25, 2018

DOI: 10.3791/57776-v

Andrey Tokarev1, Matthew Creegan1, Michael A. Eller1, Mario Roederer2, Diane L. Bolton1

1US Military HIV Research Program, Henry M. Jackson Foundation,Walter Reed Army Institute of Research, 2Vaccine Research Center, NIAID,NIH

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Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article describes a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo. This approach allows for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells, specifically applied to SIV-infected CD4 + T cells isolated from rhesus macaques.

Key Study Components

Area of Science

  • Neuroscience
  • Immunology
  • Host-pathogen interactions

Background

  • Understanding the unique characteristics of productively infected cells.
  • Identifying host cofactors that facilitate viral infections.
  • Developing targeted therapeutic interventions.
  • Providing quantitative measures for protein and mRNA within single cells.

Purpose of Study

  • To quantify gene and protein expression in single cells.
  • To compare SIV-infected and uninfected CD4 + T cells.
  • To enhance understanding of host-pathogen interactions.

Methods Used

  • Cell sorting procedure demonstrated by a senior technician.
  • Preparation of assay mix with 96 gene expression assays.
  • Pipetting of assay into a 96 well PCR plate.
  • Use of commercially available reagents for the assay.

Main Results

  • Identification of differentially expressed genes and proteins.
  • Quantitative data on protein and mRNA levels in single cells.
  • Insights into the characteristics of SIV-infected cells.

Conclusions

  • The methodology provides a robust framework for studying viral infections.
  • It facilitates the exploration of therapeutic targets in infected cells.
  • Future applications may extend to other viral pathogens.

Frequently Asked Questions

What is the main advantage of this technique?
The technique provides quantitative measures for both protein and mRNA within single cells.
Who demonstrates the cell-sorting procedure?
Matthew Creegan, a senior technician from the flow cytometry core in Doctor Michael Eller's laboratory.
What is the purpose of the assay mix?
The assay mix quantifies the expression of multiple genes in single cells.
How are the assays prepared?
Assays are combined into an RNase, DNase free tube and diluted appropriately.
What type of cells are studied in this research?
SIV-infected CD4 + T cells isolated from rhesus macaques.
What can this method help researchers understand?
It helps answer key questions about host-pathogen interactions and therapeutic targeting.

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV+ T células isoladas de macacos rhesus.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das interações hospedeiro-patógeno, como quais são as características únicas das células produtivamente infectadas, quais cofatores de hospedeiro permitem que os vírus estabeleçam infecção produtiva e como direcionar essas células em intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece medidas quantitativas tanto para proteínas quanto para mRNA dentro de células únicas, e a maioria dos reagentes estão disponíveis comercialmente. Demonstrando o procedimento de triagem celular estará Matthew Creegan, um técnico sênior do núcleo de citometria de fluxo no laboratório do Doutor Michael Eller.

Para começar, em uma estação de trabalho de biologia molecular pré-PCR designada, prepare a mistura de ensaios combinando 96 ensaios de expressão genética em um tubo RNase, livre de DNase certificando-se de adicionar cada ensaio a uma concentração final de 180 nanomolar de primers dianteiros e invertidos. Adicione o tampão de suspensão de DNA para obter a diluição apropriada da mistura de ensaio. Para cada matriz de chip 96 por 96, pipeta seis microliters de cada ensaio em um poço designado de uma placa PCR de 96 poços, em seguida, selar a placa com um adesivo.

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