Name: Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro usando ácidos graxos, colesterol e hipóxia. Este método permite testar compostos que afetam a sobrevivência e diferenciação das HSCs em condições fisiológicas.

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Agradecemos a M. Haraguchi e S. Tamaki pelo apoio técnico e gestão de laboratório e K. Shiroshita por tirar fotos. O HK foi apoiado em parte pelo KakenHI Grant da MEXT/JSPS (bolsa nº 19K17847) e pelo Centro Nacional de Saúde e Medicina Global. A KT foi apoiada em parte por subvenções kakenhi da MEXT/JSPS (subvenção nº 18H02845 e 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (grant nos 26-001 e 19A2002), AMED (grant nos. JP18ck0106444, JP18ae0201014 e JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation e Takeda Science Foundation.

O protocolo segue as diretrizes do Centro Nacional de Saúde e Medicina Global. Todos os procedimentos experimentais realizados em camundongos são aprovados pelo Comitê Nacional de Experimentos em Animais e Saúde Global. NOTA: Uma visão geral do protocolo é ilustrada na Figura 1.
1. Preparação lipídica
<ol><li>Dissolver os seguintes lipídios em metanol em tubos de vidro nas concentrações indicadas: palmitato de sódio, 16 mg/mL; oleato de sódio, 30 mg/mL; e colesterol, 4 mg/mL. Armazene a solução lipídica a -30 °C e descongele a amostra antes de usar.</li>
	<li>Misture as soluções lipídicas preparadas na etapa 1.1 em um tubo de vidro fresco nas doses necessárias para obter a concentração final de 100 μg/mL palmitato, 100 μg/mL oleato e 20 μg/mL colesterol. Por exemplo, ao preparar 10 mL de mídia cultural, misture 62,5 μL de solução palmitate, 33 μL de solução oleate e 50 μL de solução de colesterol no tubo de vidro.</li>
	<li>Evaporar o metanol passando gás nitrogênio através da solução lipídica(Figura 2A e 2B). Se o gás nitrogênio não estiver disponível, passe o ar através da solução usando um auxílio-pipeta.</li>
	<li>Evapora completamente o metanol restante aquecendo o tubo de vidro em um banho de água a 37 °C (Figura 2C). NOTA: O uso de uma alta concentração de gás N2 no espaço confinado é potencialmente prejudicial. Embora o volume utilizado no protocolo para evaporar o metanol seja limitado e, portanto, seja considerado seguro, ventilar a sala adequadamente e rotular áreas de concentrações potencialmente altas de gás N2 é importante caso ocorra um vazamento inesperado de gás.</li>
</ol>2. Preparação média
<ol><li>Prepare o meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 (com HEPES e glutamina). Adicione sulfato de penicilina e estreptomicina ao médio até a concentração final de 50 unidades e 50 μg/mL, respectivamente. O meio DMEM/F12 contendo antibióticos pode ser armazenado a 4 °C por pelo menos 2 meses.</li>
	<li>Adicione 4% c/v de albumina de soro bovino (BSA) ao meio Eagle modificado (DMEM)/F12 modificado de Dulbecco (com HEPES e glutamina).</li>
	<li>Ajuste o pH do médio para o pH 7.4-7.8 usando a solução NaOH, tipicamente para pH 7.6.</li>
	<li>Adicione o meio ao tubo de vidro preparado na etapa 1. Para alcançar uma solução com solubilidade máxima, recomenda-se adição de 3-15 mL médio.</li>
	<li>Dissolva completamente os lipídios por sônica (ótimo: mais de 20 minutos de sônica). Após a dissolução da BSA e lipídios, a amostra deve ser armazenada a -80 °C e usada dentro de 2 meses. Descongele imediatamente antes do uso.</li>
	<li>Adicione 1/1.000 da mistura de insulina, transferrina, selenita de sódio e etanol (ITS-X) à mistura DMEM/F12. Filtre o meio misto usando um filtro de 0,22 μm (designado como "mídia cultural"). Antes do uso, adicione o fator célula-tronco humana (SCF) e a trombopoietina humana (TPO) aos meios de cultura em uma concentração final de 3 ng/mL cada. Depois de adicionar as citocinas e ITS-X, o meio não pode ser armazenado.</li>
	<li>Tampão de coloração: Adicione 10% de FCS ao soro fisco tampão tampão de fosfato livre de ca e mg (PBS). Esta solução pode ser armazenada a 4 °C por 2 semanas.</li>
	<li>Descongelamento da mídia: Adicione 10% de FCS ao DMEM/F12. Esta solução é de uso único.</li>
	<li>Solução de estoque cytokine: Dissolva cada SCF humano ou TPO humano em PBS (Ca- and Mg-free) a 20 μg/mL. Esta solução pode ser armazenada a -80 °C por pelo menos um ano sem perda de atividade. Uma vez descongelado, armazene a solução de estoque a 4 °C e use dentro de 1 mês. NOTA: Examine o lote após cada compra para evitar variação nos contaminantes da BSA. Cultura HSCs ao mesmo tempo com diferentes lotes de BSA e examinar o número fenotípico HSC no dia 7, conforme descrito abaixo. Se um lote BSA mostrar um número baixo ou frequência de células CD34+ (por exemplo, menos da metade do número de células de entrada), evite usar este lote.</li>
</ol>3. Preparação da medula óssea humana CD34+ células
<ol><li>Compre células de medula óssea CD34+ e armazene as células em nitrogênio líquido até o uso. Alternativamente, as células de medula óssea de um voluntário saudável ou células sanguíneas frescas do cordão umbilical podem ser usadas mediante aprovação do comitê ético do instituto e do consentimento dos doadores.</li>
	<li>Aqueça 10 mL de descongelamento em um tubo cônico de 15 mL em um banho de água de 37 °C.</li>
	<li>Descongele as células congeladas em frascos em um banho de água de 37 °C dentro de 2 minutos. Depois de limpar o frasco com 70% de etanol para remover contaminantes, transfira as células para o tubo cônico de 15 mL contendo o meio pré-aquecido da etapa 3.2.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 15 mL a 200 × g por 15 min a temperatura ambiente. Aspire o supernatante cuidadosamente para manter a pelota intacta (deixando < 50 μL de média). Resuspenda as células com o meio restante e transfira-as para um tubo de 1,5 mL no gelo. NOTA: A exposição a amostras derivadas do homem diretamente na mucosa, incluindo o tecido ocular ou ferido, pode causar infecção por patógenos conhecidos ou desconhecidos; assim, luvas e óculos são recomendados ao manusear células humanas. Mesmo que as células CD34+ compradores testem negativo para o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV) e o vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV1), o monitoramento cuidadoso deve ser realizado de acordo com as diretrizes institucionais caso ocorra uma incidência de exposição. Siga as diretrizes institucionais ao descartar materiais expostos às células humanas.</li>
</ol>4. Classificação de HSCs
<ol><li>Rotule as células com anticorpos conjugados fluorocromo. Misture 50 μL de tampão de coloração mais 10 μL de anti-CD34-FITC, 2 μL de anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL de anti-CD90-PE-Cy7 e 10 μL de anti-CD45RA-PE. Resuspende a pelota celular na mistura de anticorpos. Incubar as células por 30 min a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de coloração para lavar os anticorpos. Centrifugar os tubos a 340 × g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Resuspene a pelota celular em 0,5 mL de tampão de coloração + 0,1% de iodeto de propidium. Transfira a suspensão para um tubo de 5 mL usando um filtro de 40 μm.</li>
	<li>Gate os HSCs fenotípicos dentro do PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fração usando o FACS Aria-IIIu e classifique as células em um tubo de 1,5 mL preenchido com 500 μL de mídia cultural(Figura 3). Usando a estratégia de gating mostrada na Figura 3, ~10% das células CD34+ devem ser HSCs fenotípicas. Registre o número de células classificadas para calcular o volume de mídia para resuspensar as células na etapa 5.3. NOTA: A estratégia de gating é realizada como descrito anteriormente16, omitindo a coloração do marcador de linhagem dada a baixa expressão de marcadores de linhagem na fração CD34+CD38 de indivíduos saudáveis17 .</li>
	<li>Centrifugar as células classificadas a 340 × g por 5 min a 4 °C e descartar o supernacido. Aspire cuidadosamente o supernatante para garantir que a pelota permaneça intacta.</li>
	<li>Armazene as células classificadas no gelo até a cultura. NOTA: A compensação da fluorescência da sobreposição espectral deve ser realizada durante o primeiro experimento.</li>
</ol>5. Cultura celular
<ol><li>Transfira 200 μL dos meios de cultura contendo citocinas preparadas na etapa 2 em placas de 96 poços de fundo plano.</li>
	<li>Para evitar a evaporação do meio, encha todos os poços nãousados com 100-200 μL de PBS.</li>
	<li>Resuspend os HSCs classificados em mídia cultural sem citocinas a 60 células/μL.</li>
	<li>Aliquot 600 HSCs/bem (10 μL de suspensão celular) em cada poço. O número do celular pode ser alterado. Menos de 300 células levarão a maior variação técnica e, portanto, mais poços por condição são necessários para detectar diferenças biológicas. A colheita de mais de 1000 células em um único poço deve ser evitada devido à citocina/privação de nutrientes ou acúmulo de citocinas/quimioterapias desfavoráveis.</li>
	<li>Cultume as células em uma incubadora multi-gás umidificada a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 e 1% O2. </li>
	<li>Para culturas ao longo de 7 dias, recomenda-se substituir metade do volume de mídia a cada 3-4 dias. Aspire cuidadosamente 100 μL de mídia por pipetação e adicione 100 μL de mídia de cultura recém-preparada contendo citocinas a cada poço. A mídia cultural deve ser pré-aquecida a 37 °C.</li>
</ol>6. Análise de fenótipos marcadores utilizando citometria de fluxo
NOTA: Embora as células devam ser analisadas após 7 dias de cultura, a duração da cultura pode ser alterada.
<ol><li>Descarte 170 μL do meio usando uma pipeta de 8 canais.</li>
	<li>Rotule as células com a mistura de anticorpos. Misture 0,5 μL de anti-CD34-FITC, 0,1 μL de anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 0,25 μL de anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL de anti-CD45RA-PE e 9 μL de tampão de coloração por poço. Adicione 10 μL da mistura à placa de 96 poços e incuba as células por 30 min a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Para lavar os anticorpos, adicione 100 μL de tampão de coloração aos poços e centrifufique as placas a 400 × g por 5 min a 4 °C usando baixa aceleração e desaceleração média.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente 100 μL do supernante para manter as células na parte inferior dos poços, em seguida, resuspend as células em 200 μL de tampão de coloração + 0,1% v/v de PI + 1% v/v de microesferas fluorescentes (por exemplo, Fluoroferas de Verificação de Fluxo).</li>
	<li>Configure o instrumento de citometria de fluxo. Adquira dados para as amostras em modo rápido com modo amostral misto ligado e volumes de captação de 100 μL.</li>
	<li>Exporte os dados no formato FCS e analise-os usando softwares como o FlowJo. Os números celulares podem ser determinados usando a contagem de contas da microesfera fluorescente. Por exemplo, se o pesquisador adicionar 2000 contas por poço e a contagem de contas for de 700, multiplique o número celular de cada fração por 2000/700 para estimar o número celular total da fração no poço. NOTA: As microesferas fluorescentes são tóxicas para células cultivadas devido à presença de formaldeído. Isso pode induzir a morte celular durante a análise. Minimizar o número de poços (<50 poços) analisados continuamente para evitar viés.</li>
</ol>7. Transplante de HSCs humanos
NOTA: A atividade de repopulação de células cultivadas é validada por transplante para camundongos imunodeficientes. Todos os procedimentos devem ser aprovados por comitês de experimentos animais ou seus equivalentes.
<ol><li>Como doadores, preparem um número suficiente de camundongos nod-SCID-IL2rg-nulos (NOG) de 8-12 semanas. Como os camundongos NOG são altamente suscetíveis à infecção, mantenha as gaiolas de reprodução o mais limpas possível e alimente os camundongos com uma dieta esterilizada e água.</li>
	<li>Cultura um número adequado de HSCs para transplante, conforme descrito na etapa 5. Por exemplo, quando 5000 HSCs (dia 0 equivalente) são transplantados para 6 camundongos receptores, cultura 35.000-40.000 HSCs em 40 poços de uma placa de 96 poços (200 μL de mídia cultural por poço) ou em 8 poços de uma placa de 24 poços (1 mL de mídia cultural por poço). Cultura as células por 2 semanas com meias-mídia muda a cada 3-4 dias em uma incubadora multi-gás umidificada a 37 °C com 5% de CO2 e 1% O2. A duração da cultura pode ser alterada.</li>
	<li>Irradiar camundongos NOG a 2,5 Gy às 6-24 h antes do transplante.</li>
	<li>Colete os HSCs cultivados em tubos de 1,5 mL. Centrifugar os tubos a 340 ×g por 5 min a 4°C.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente os supernantes e resuspenque as células em tampão de coloração gelo estéril a uma densidade celular de 5000 HSCs (dia 0 equivalente) por 200 μL. Transfira esta suspensão para tubos de polipropileno de 3 mL. Para esterilizar o tampão de coloração, filtre-o usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Antes do transplante, anestesia os camundongos por sevoflurano ou inalação de isoflurano.</li>
	<li>Para transplantar 5000 HSCs cultivados (dia 0 equivalente), injete 200 μL de suspensão celular na veia da cauda ou seio orbital retrô de camundongos NOG irradiados na etapa 7.1 usando uma seringa de 1 mL e agulha de calibre 27. HSCs de medula óssea recém-isolados ou descongelados podem ser transplantados como controle. As luvas devem ser esterilizadas com 70% de v/v de etanol entre cada procedimento.</li>
</ol>8. Análise da frequência de células derivadas do homem no sangue periférico
<ol><li>Para examinar a repopulação das células humanas, recolham o sangue periférico em 1, 2 e 3 meses após o transplante.</li>
	<li>Antes de coletar o sangue periférico, anestesiar os camundongos por inalação de sevoflurano.</li>
	<li>Colete 40-80 μL de sangue periférico do seio retro-orbital usando tubos capilares de vidro heparinizados e suspenda esta amostra em 1 mL de PBS + heparina (1 U/mL) em tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão sanguínea a 340 × g por 3 min a 4 °C. Descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em 1 mL de PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) por 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira o supernante para outro tubo de 1,5 mL e centrífuga a 340 × g por 3 min.</li>
	<li>Para lise de glóbulos vermelhos, resususpenda as células em 0,17 M NH4Cl por 5 min.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular 340 × g por 3 min a 4 °C. Resuspenha as células em 50 μL de tampão de coloração contendo 0,3 μL de bloco fc anti-mouse. Incubar esta amostra a 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Adicione os seguintes anticorpos para coloração do marcador de superfície: 0,3 μL de mouse CD45-PE-Cy7, 0,3 μL mouse Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL de CD45-BV421 humano, 0,3 μL de CD13-PE humano, 1,2 μL de CD33-PE humano, 0,3 μL de CD19-APC humano, 0,3 μL de CD3-APC-Cy7 humano. Incubar as células a 4 °C por 15 min.</li>
	<li>Lave uma vez com 1 mL de tampão de coloração e centrífuga a 340 × g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o supernascimento e resuspenque as células em 200 μL de tampão de coloração + 0,1% v/v de PI.</li>
	<li>Transfira a suspensão da célula para uma placa de fundo plana de 96 poços e adquira dados usando o citômetro de fluxo no modo rápido com o modo de amostra de mixagem ligado e um volume de absorção de 100 μL.</li>
	<li>Exporte os dados em formato FCS para análise usando softwares como o FlowJo.</li>
	<li>Configure o citómetro de fluxo. Adquira dados para as amostras em modo rápido com o modo de amostra de mix e um volume de absorção de 100 μL.</li>
	<li>Exporte os dados em formato FCS para análise usando softwares como o FlowJo.</li>
</ol>

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<li>Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+SCID-repopulating+cells+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).</li>
<li>Kikushige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Flt3+is+expressed+at+the+hematopoietic+stem+cell+and+the+granulocyte%2Fmacrophage+progenitor+stages+to+maintain+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+All-Recombinant+Protein-Based+Culture+System+Specifically+Identifies+Hematopoietic+Stem+Cell+Maintenance+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses associados ao presente estudo.

Recentemente, vários métodos de expansão de HSCs com diferenciação mínima foram relatados18,19,20,21. Embora esses métodos sejam excelentes, os HSCs são forçados a ativar seus ciclos celulares na presença de altos níveis de citocinas, o que difere da situação in vivo em que os HSCs apresentam ciclos mínimos. Este protocolo é útil para manter os HSCs como quiescentes, como observado in vivo, recapitulando o microambiente da medula óssea.
Ao cultivar HSCs humanos sob condições de citocinas baixas, ricas em lipídios e hipoxicas, os HSCs mostraram ciclismo mínimo enquanto mantinham seus fenótipos marcadores. O passo crítico neste protocolo é a preparação de meio contendo alta concentração de ácidos graxos e colesterol e baixas concentrações de citocinas e cultura sob hipóxia (Passo 1, Passo 2 e Passo 4). Sem colesterol e/ou ácidos graxos, a taxa de manutenção dos HSCs sob baixas concentrações de citocinas diminui22. A colheita de células em condições hipóxiis também é importante, como relatado anteriormente23.
As condições de cultura foram semelhantes às utilizadas para HSCs murinas, com exceção das concentrações de citocinas. Os HSCs murine sobrevivem sem TPO, enquanto os HSCs humanos requerem pelo menos 2 ng/mL de TPO com 3 ng/mL de SCF22. Como a concentração de TPO é muito maior do que a do soro humano (~100 pg/mL), as condições utilizadas neste protocolo podem estar faltandofatores específicos para apoiar a sobrevivência dos HSCs humanos. A adição de seu ligante FLT3LG diminui ligeiramente a exigência de TPO para manter os HSCs22.
Os HSCs humanos requerem maiores concentrações de colesterol em comparação com os HSCs murine, presumivelmente devido à incapacidade de induzir a expressão de enzimas sintetizadoras de colesterol e suscetibilidade à lipotoxicidade sob altas concentrações (>400 μg/mL) de ácidos graxos22. Embora apenas a combinação de ácidos palmíticos, oleicos, linóricos e esteáricos tenha sido testada, que são abundantemente encontradas no soro humano, outras combinações de lipídios devem ser avaliadas para reduzir a lipotoxicidade e melhorar a taxa de manutenção de HSCs funcionais.
Embora a atividade de repopulação de HSCs humanos cultivados em camundongos imunodeficientes após duas semanas de cultura tenha sido confirmada22, este sistema de cultura não recapitula totalmente as funções de nicho dos HSCs in vivo. A expressão do CD45RA foi relatada para aumentar e a capacidade de repopulação é inferior à dos HSCs22recém-classificados . No entanto, as concentrações de nutrientes, como glicose, aminoácido, piruvato e insulina, que são adicionados ao meio em níveis suprafisiológicos, podem ser otimizadas. Contaminantes na BSA também podem comprometer a manutenção dos HSCs18,25. Além disso, algumas células cultivadas sofrem morte celular, enquanto outras passam por divisão celular; assim, a manutenção do número total da célula pode não indicar o estado quiescente de cada célula.
Apesar dessas limitações, as condições de cultura descritas no protocolo desenvolvido neste estudo ajudarão a avançar na pesquisa e engenharia dos HSCs, particularmente em condições quase fisiológicas. Condições culturais que mantenham HSCs com mínima diferenciação e atividade ciclística seriam adequadas para testar compostos biológicos e químicos que atuam especificamente em HSCs, manipulando HSCs via transdução de lentivírus ou edição de genomas sem a perda de caule, e elucidando o passo inicial de transformação induzido por genes associados à leucemia.

Células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e células progenitoras multipotentes (MPPs) formam coordenadamente um reservatório para reposição contínua de células diferenciadas para manter hematopoiese ao longo da vida em humanos1. A quiescência do ciclo celular é uma característica proeminente dos HSCs, diferenciando-os dos MPPs2. Convencionalmente, acredita-se que os HSCs residam no ápice da hierarquia do sistema hematopoiético, produzindo todas as células sanguíneas diferenciadas. Este modelo hierárquico foi deduzido principalmente a partir de experimentos de transplante3. No entanto, estudos recentes indicaram que a dinâmica dos HSCs difere in vivo em relação às dos experimentos de transplante4,5,6,7. Experimentos de rastreamento de linhagem usando vários sistemas de codificação de barras revelaram que os HSCs de murina murina fenotípica não são um tipo de célula única que contribui para hematopoiese de estado estável, e MPPs, que exibem atividade limitada de auto-renovação nas configurações de transplante, fornecem continuamente células sanguíneas maduras4,5,8. Em contrapartida, a contribuição dos HSCs para as células maduras é aumentada após a lesão da medula óssea4. Isso pode ser atribuído a alterações drásticas no microambiente após a ablação da medula óssea, incluindo o transplante de medula óssea. Embora a aplicação do rastreamento de linhagem de células murinas em células humanas seja difícil, a análise filogenética que combina o isolamento de colônias derivadas de células únicas e o sequenciamento de genomas inteiros revelaram uma propriedade semelhante do sistema hematopoiético, no qual tanto os HSCs quanto os MPPs são responsáveis pela produção diária de células maduras7. Assim, embora o transplante seja essencial para examinar a atividade murina ou humana do HSC, outros modelos experimentais são necessários para entender os comportamentos dos HSCs em condições fisiológicas.
Métodos de cultivo para HSCs têm sido estudados detalhadamente para entender suas aplicações e características clínicas. Os HSCs humanos podem ser expandidos in vitro usando uma combinação de citocinas, reconstituição de matrizes extracelulares, remoção de antagonistas de auto-renovação, cocultura com células mesenquimais ou endoteliais, adição de albumina ou sua substituição, transdução de fatores de transcrição de autocon renovação e adição de compostos de pequenas moléculas9,10. Alguns desses métodos, incluindo a adição de pequenos compostos SR111 e UM17112,foram testados em ensaios clínicos com resultados promissores9. Considerando a natureza quiescente dos HSCs in vivo, manter HSCs com ciclo de células mínimas é fundamental para recapitular o comportamento do HSC in vitro. HSCs quiescentes e proliferadores apresentam entrada diferencial do ciclo celular13, estado metabólico14e tolerância contra múltiplas tensões15 . Os métodos utilizados para manter a quiescência dos HSCs humanos in vitro são limitados.
Ao imitar o microambiente da medula óssea (hipóxica e rica em lipídios) e otimizar a concentração de citocinas, os HSCs humanos podem ser mantidos indiferenciados e quiescentes sob a cultura. Recapitulando a natureza quiescente dos HSCs in vitro melhorará a compreensão das propriedades estatais estáveis dos HSCs e permitirá a manipulação experimental dos HSCs.

<table><tbody><tr><td>Células progenitoras CD34 + da medula óssea humana</td><td>Lonza</td><td>2M-101C</td><td></td></tr><tr><td>NOD / Shi-scid, IL-2R &gamma; KO Jic</td><td>In-Vivo Science Inc.</td><td></td><td></td>https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html</tr><tr><td>Anti-humano CD34-FITC (clone: 581)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 560942; RRID: AB_10562559</td><td></td></tr><tr><td>CD38-PerCP-Cy5.5 anti-humano</td><td>BD biociências</td><td>Cat# 551400; RRID: AB_394184</td><td></td></tr><tr><td>Biociências anti-CD45RA-PE</td><td>BD</td> humanas <td>Cat# 555489; RRID: AB_395880</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561558; RRID: AB_10714644</td><td></td></tr><tr><td>CD13-PE anti-humano (clone: WM15)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 301703; RRID: AB_314179</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD33-PE (clone: WM53)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561816; RRID: AB_10896480</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD19-APC (clone: SJ259)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 363005; RRID: AB_2564127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD3-APC-Cy7 (clone: SK7)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561800; RRID: AB_10895381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD45-BV421 (clone: HI30)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 563880; RRID:AB_2744402</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 103114; RRID: AB_312979</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 557853; RRID: AB_396898</td><td></td></tr><tr><td>Bloco Fc (anti-rato CD16/32) (clone: 2.4-G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 553142; RRID: AB_394657</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>Cat# 14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 51500056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Meiji Seika</td><td></td><td></td>PGLD755</tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Meiji Seika</td><td>SSDN1013</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Palmitato de sódio</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>Cat# P0007</td><td></td></tr><tr><td>Oleato de sódio</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>Cat# O0057</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>Cat# C0318</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Amônio</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 017-2995</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de Sódio</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 191-01305</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2Na</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Na</td><td>MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.,&nbsp;LTD.</td><td>Cat# 224122557</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 193-17791</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Nacalai Tesque Cat</td><td>#&nbsp; 10927-54</td><td></td></tr><tr><td>SCF humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-18</td><td></td></tr><tr><td>Ligante humano recombinante Flt3</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Life Technologies</td><td>Cat# P3566</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroesferas de verificação de fluxo</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# 7547053</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versão 10</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria3u</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VELVO-CLEAR VS-25 (sonicador)</td><td>VELVO-CLEAR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de gás nitrogênio</td><td>KOIKE SANSHO CO., LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de gás</td><td>Astec</td><td>Cat# IM-055</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora multigás</td><td>Astec</td><td>Cat# SMA-30DR</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidro, 16 mL</td><td>Maruemu corporation</td><td>N-16</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidro, 50 mL</td><td>Maruemu corporation</td><td>NX-50</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unidade de Filtro de Seringa, 0.22&nbsp; &micro; M, Polietersulfona, 33&nbsp; mm, esterilizado por gama</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Células-tronco hematopoiéticas humanas (HSCs), como outros HSCs mamíferos, mantêm hematopoiese ao longo da vida na medula óssea. Os HSCs permanecem quiescentes in vivo, ao contrário de progenitores mais diferenciados, e entram no ciclo celular rapidamente após quimioterapia ou irradiação para tratar lesão de medula óssea ou cultura in vitro. Ao imitar o microambiente da medula óssea na presença de ácidos graxos abundantes, colesterol, baixa concentração de citocinas e hipóxia, os HSCs humanos mantêm quiescência in vitro. Aqui, é descrito um protocolo detalhado para a manutenção de HSCs funcionais no estado quiescente in vitro. Este método permitirá estudos sobre o comportamento dos HSCs humanos em condições fisiológicas.

Após 7 dias de cultivo dos HSCs purificados, até 80% das células exibiam fenótipos marcadores de CD34+CD38- (Figura 4A). O número total de células dependia da concentração de citocinas(Figura 4B). Maiores concentrações de SCF e TPO induziram a entrada no ciclo celular, proliferação e diferenciação(Figura 4B). O número de HSCs fenotípicos caracterizados pelos fenótipos marcadores de CD34+CD38-CD90+CD45RA- aumentou proporcionalmente às concentrações de SCF ou TPO(Figura 4B),enquanto a frequência entre as células totais diminuiu(Figura 4C). Os números totais de células foram iguais nas combinações de 1,5 ng/mL SCF e 4 ng/mL TPO e as combinações de 3 ng/mL SCF 3 e 2 ng/mL TPO, sugerindo que os HSCs são quiescentes durante a ativação mínima do ciclo celular. Dadas as diferenças individuais, recomenda-se a titulação de citocinas para cada doador de medula óssea.
Após 3 meses de transplante de HSCs de medula óssea adulta cultivada, a reconstituição pode ser avaliada como sua frequência no sangue periférico das células CD45+ murinas CD45-Ter119. Três linhagens, incluindo células CD19+ B, células mielóides CD13/CD33+, e células T CD3+ foram reconstituídas em camundongos NOG transplantados com HSCs recém-descongelados ou HSCs cultivados(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig01.jpg"> Figura 1. Visão geral do procedimento. O resumo gráfico do procedimento envolveu a triagem, a colheita e a análise de células-tronco hematopoiéticas humanas (HSCs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig02.jpg"> Figura 2. Procedimento para evaporar metanol da solução lipídica. A) Cilindro de gás nitrogênio com regulador de gás. B) Procedimento para a passagem de gás nitrogênio através da solução lipídica dissolvida em metanol. C) Lipídios aderindo ao fundo do tubo de vidro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig03.jpg"> Figura 3. Estratégia de gating para classificação de HSCs. As tramas mostram células de CD34+CD38-CD90+CD45RA. Aproximadamente 10% das células CD34+ eram HSCs fenotípicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig04.jpg"> Figura 4. Números de células representativas após 7 dias de cultivo. A) Gráfico de classificação celular ativado pela fluorescência representativa após a cultura dos HSCs em SCF (3 ng/mL) e TPO (2 ng/mL). A fração 1 foi enriquecida para células vivas, a fração 2 foi enriquecida para células mortas, e a fração 3 foi enriquecida para detritos. Números coloridos em rosa indicam a frequência (%) da fração fechada. B) Número de todos os HSCs, CD34+CD38- células, e CD34+CD38-CD90+CD45RA- células após a culminar 600 HSCs sob as condições indicadas de citocinas. Linhas tracejadas vermelhas indicam o número inicial de células de entrada. S: SCF, T: TPO. Desvio padrão ± médio, n = 4. Os números seguintes a S e T indicam a concentração (ng/mL) de cada citocina. C) Frequência de células CD34+CD38- e CD34+CD38-CD90+CD45RA- sob as condições indicadas de citocina. S: SCF, T: TPO. Desvio padrão ± médio, n = 4. As barras de erro para células cultivadas em SCF (1 ng/mL) e TPO (0 ng/mL) foram omitidas devido aos seus altos valores (37,7 e 47,9, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig05.jpg"> Figura 5. Representante FACS parcelas de camundongos doadores após 3 meses de transplante. Um total de 5.000 HSCs recém-descongelados (painéis superiores) e 2 semanas cultivados (3 ng/mL SCF e 3 ng/mL TPO; painéis inferiores) foram transplantados em camundongos NOG. hCD19 marca células B humanas, hCD13 e hCD33 marcam células mielóides humanas, e hCD3 marca células T humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig05large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo permite a manutenção de células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro, imitando o microambiente de medula óssea usando ácidos graxos abundantes, colesterol, menores concentrações de citocinas e hipóxia.

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Quiescência do ciclo celular é uma característica fundamental das células-tronco hematopoiéticas. Este protocolo ajuda a entender o comportamento de HSCs humanos quiescentes in vitro em condições quase fisiológicas. Usando este protocolo, os pesquisadores podem testar o efeito de vários compostos, nutrientes ou proteínas que regulam o status do ciclo celular, bem como a diferenciação dos HSCs de forma escalável sem o uso de modelos animais.As drogas anticâncgenas têm efeitos variados na sobrevivência de HSCs quiescentes e progenitores ciclísticos. Este protocolo permite encontrar agentes que poupem HSCs quiescentes ou agentes que danifiquem seletivamente células-tronco quiescentes. Demonstrando o procedimento estará Hiroshi Kobayashi, pesquisador sênior do Laboratório Takubo.Para começar, dissolva 16 miligramas por palmitato de sódio mililitro, 30 miligramas por oleato de sódio mililitro, e quatro miligramas por colesterol mililitro em metanol em tubos de vidro. Armazene as soluções lipídicas a 30 graus Celsius negativos e descongele-as antes do uso. Em um tubo de vidro fresco, misture as soluções lipídicas para obter a concentração final de 100 microgramas por palmitato mililitro, 100 microgramas por oleato mililitro e 20 microgramas por colesterol mililitro.Evaporar o metanol passando gás nitrogênio através da solução lipídica. Evapora completamente o metanol restante aquecendo o tubo de vidro em um banho de água a 37 graus Celsius. Prepare o meio DMEM/F-12 com HEPES e glutamina.Adicione sulfato de penicilina e estreptomicina para uma concentração final de 50 unidades e 50 microgramas por mililitro, respectivamente. O médio pode ser armazenado a quatro graus Celsius por pelo menos dois meses. Adicione 4% de BSA ao meio DMEM/F-12 com HEPES e glutamina, em seguida, ajuste o pH do médio para 7,6 usando solução de hidróxido de sódio.Adicione o meio ao tubo de vidro com os lipídios. Dissolva completamente os lipídios por sônica. Se o meio estiver opaco após a sônica, estenda o tempo de sonicação.Quando o BSA e os lipídios são dissolvidos, as amostras devem ser armazenadas a 80 graus Celsius negativos e usadas dentro de dois meses. Adicione 0,001X de insulina, transferrina, selenita de sódio e mistura de amina de etanol ao DMEM/F-12 e depois filtre o meio misto usando um filtro de 0,22 micrômetro. Antes do uso, adicione o fator célula-tronco humana ou SCF e trombopoietina humana ou TPO à mídia cultural em uma concentração final de três nanogramas por mililitro cada.Transfira 200 microliters dos meios de cultura previamente preparados com citocinas para placas de fundo plano de 96 poços. Para evitar a evaporação do meio, encha todos os poços nãousados com 100 a 200 microliters de PBS. Resuspend as células-tronco hematopoiéticas classificadas ou HSCs em mídia cultural sem citocinas a 60 células por microliter.Alíquota de 600 células em cada poço. Menos de 300 células levarão a maior variação técnica e a cultura de mais de 1.000 células em um único poço deve ser evitada devido à privação de nutrientes ou acúmulo de citocinas desfavoráveis ou quimiocinas. Cultue as células em uma incubadora multi-gás umidificada a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 1% de oxigênio.Após sete dias de cultivo dos HSCs purificados, até 80% das células exibiram fenótipos negativos cd34 e CD38 negativos. O número total de células dependia da concentração de citocinas. Maiores concentrações de SCF e TPO induziram a entrada no ciclo celular, proliferação e diferenciação.O número de HSCs fenotípicos caracterizados pelo marcador CD34 positivo, CD38 negativo, CD90 positivo e CD45 RA fenotipos negativos aumentou em proporção às concentrações de SCF ou TPO, enquanto a frequência entre as células totais diminuiu. Após três meses de transplante de HSCs de medula óssea adulta cultivada, a reconstituição pode ser avaliada em função de sua frequência no sangue periférico do cd45 positivo do CD45, células negativas do CD45 Ter119 negativos. Três linhagens, incluindo células B positivas de CD19, células mielóides cd33 positivas e células T positivas CD3 foram reconstituídas em camundongos NOG transplantados com HSCs recém-descongelados ou cultivados.Seguindo a cultura, os HSCs podem ser submetidos a perfis de expressão genética, como pcr em tempo real e sequenciamento de RNA. A validação funcional usando transplante em camundongos deficientes imunológicos também pode ser realizada. Os pesquisadores podem comparar diretamente o ciclismo e os HSCs quiescentes em condições definidas, ajustando as concentrações de citocinas.Isso ajudará a entender os programas de auto-renovação específicos do HSC, mecanismos de resistência ao estresse e propriedades metabólicas, que são difíceis de testar as configurações in vivo.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo demonstra como manter saudável, indiferenciada-tronco embrionárias humanas (ES) células.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Nós otimizamos uma técnica de microencapsulação como uma plataforma eficaz para a propagação 3D e diferenciação de células-tronco embrionárias a endoderme e (DA) dopaminérgicos neurônios. Ele também fornece uma oportunidade para imuno-isolamento de células do hospedeiro durante o transplante. Esta plataforma pode ser adaptado para outros tipos de células.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Aprenda a manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro usando ácidos graxos, colesterol e hipóxia. Este método permite testar compostos que afetam a sobrevivência e diferenciação das HSCs em condições fisiológicas.

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

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