Complementação da Atividade de Emenda por um Complexo Galectin-3 - U1 snRNP on Beads

Este relatório fornece a evidência experimental para a documentação de que um complexo snRNP galectina-3 U1 se liga ao substrato pré-mRNA, forma um complexo funcional e leva a produtos da reação de splicing. Este protocolo utiliza a galectina-3 U1 snRNP imunoselecionada em grânulos acoplados covalentemente a anticorpos anti-gal3 para iniciar a reação de splicing, que pode progredir até a conclusão. Uma etapa crítica no protocolo é a remoção cuidadosa do líquido após a peletização dos grânulos contendo o complexo galectina-3 U1 snRNP e seu uso imediato no início da reação de splicing.

Para esgotar os snRNPs U1 do extrato nuclear, incube 200 microlitros de extrato nuclear com 100 microlitros de grânulos anti-U1. Adicione cinco microlitros de RNAs à mistura e gire o microtubo cabeça sobre cauda a quatro graus Celsius por uma hora. Pulverize a mistura por centrifugação e recolha o material não ligado usando uma seringa Hamilton.

Dialisar todo o volume de extrato nuclear empobrecido em U1 junto com uma alíquota separada de 50 microlitros do extrato nuclear original não esgotado em compartimentos separados de um microdialisador com agitação por 75 minutos contra 60% de tampão D a quatro graus Celsius. Use uma membrana de diálise com um corte de peso molecular de 8K. Imediatamente após a diálise, divida as preparações em alíquotas de 20 microlitros, congele-as em um banho de etanol com gelo seco e armazene-as a 80 graus Celsius negativos.

Pouco antes de usar, lave as esferas anti-gal3 duas vezes com 0,5 mililitros de tampão de lavagem TX. Para cada lavagem, adicione o tampão de lavagem e centrifugue. Remova o sobrenadante primeiro com uma micropipeta e depois com uma seringa Hamilton para tirar o líquido das contas.

Fracione o extrato nuclear em um gradiente de 12% a 32% de glicerol. Combine e misture as frações de gradiente de glicerol três, quatro e cinco que estão próximas à região 10S. Prepare duas alíquotas de 150 microlitros de frações de gradiente combinadas de três a cinco e coloque-as em 50 microlitros de esferas anti-gal3.

Paralelamente, prepare duas amostras cada uma com 150 microlitros da fração um e coloque-as em 50 microlitros de esferas anti-gal3. Como controle, coloque 150 microlitros de 60% de tampão D em 50 microlitros de esferas anti-gal3. Misture delicadamente batendo nos tubos e, em seguida, gire-os da cabeça sobre a cauda a quatro graus Celsius por uma hora.

Pelete as amostras com centrifugação suave. Remova a maior parte do sobrenadante com uma micropipeta. Remova o sobrenadante usando uma seringa Hamilton inserindo cuidadosamente a ponta da agulha na parte inferior das contas.

Use os grânulos imediatamente para as reações de emenda. Monte a reação de emenda conforme descrito no manuscrito do texto e adicione-a a um conjunto de amostras de contas. Monte um conjunto idêntico de reações de emenda em um volume total de 24 microlitros, mas sem extrato nuclear empobrecido em U1 e adicione-o ao outro conjunto de contas.

Preparar uma reacção de emenda de controlo a efectuar na ausência de esferas num volume total de 12 microlitros. Esta reação de controle contém extrato nuclear, 60% tampão D e substrato de emenda radioativo. Misture os tubos delicadamente batendo e gire-os da cabeça sobre a cauda a 30 graus Celsius por 90 minutos e, em seguida, coloque a mistura em pellets por centrifugação suave.

Pare a reação e elua as proteínas dos grânulos adicionando 24 microlitros de tampão de amostra 2X SDS aos tubos contendo grânulos e 12 microlitros de tampão de amostra 2X SDS ao tubo de controle contendo extrato nuclear, mas sem grânulos. Vórtice cada tubo. Aqueça os tubos a 100 graus Celsius por sete minutos.

Centrifugue os tubos a 1.000 vezes G em um rotor de caçamba oscilante à temperatura ambiente por 10 a 15 segundos. Transfira os sobrenadantes para microtubos novos. Adicione 20 miligramas por mililitro de proteinase K para digerir e solubilizar as proteínas.

Incube os tubos a 37 graus Celsius por 40 minutos. Após a incubação, centrifugue suavemente os tubos. Dilua as ilusões do grânulo com 39,5 microlitros TE e 10 microlitros de acetato de sódio de três molares.

Diluir o controle do extrato nuclear com 63,5 microlitros de TE e 10 microlitros de acetato de sódio. Extrair e analisar o RNA conforme descrito no manuscrito do texto. Extratos nucleares depletados dos complexos U1 snRNP e gal3 U1 snRNP da região 10S do gradiente de glicerol imunoprecipitado por anti-gal3 foram misturados em uma reação de splicing.

Esta mistura de reação continha snRNA U1, bem como a proteína específica U1 U1-70K. Como esperado, o anti-gal3 precipitou gal3. O snRNA U1, a proteína U1-70K e o gal3 não foram encontrados na precipitação pré-controle imunológico.

Comparado a um extrato nuclear não depletado realizado como controle positivo, o extrato nuclear depletado de U1 snRNP não exibiu atividade de splicing. A atividade de splicing no extrato nuclear empobrecido em U1 pode ser reconstituída pelo complexo snRNP gal3 U1 ligado ao grânulo. Ambos os produtos da reação de splicing ligaram éxons e lariat de íntron excisados, bem como em intermediários foram encontrados.

Os componentes das frações três a cinco foram críticos na restauração do splicing do extrato nuclear empobrecido em U1. Quando essas frações foram substituídas apenas por tampão, nenhuma atividade de splicing pôde ser observada, indicando que os grânulos anti-gal3 não foram responsáveis pela restauração da atividade de splicing no extrato nuclear depletado de U1. Mais persuasivamente, quando as frações três a cinco foram substituídas pela fração um no procedimento de imunoprecipitação e depois adicionadas ao extrato nuclear empobrecido em U1, nenhum intermediário ou produto da reação de splicing foi encontrado. Ao tentar este protocolo, uma pessoa deve completar a imunoprecipitação enquanto a outra pessoa prepara a reação de splicing com o mínimo de atraso possível.

A análise proteômica da composição polipeptídica do SNRP U1 da galectina-3, que restaura a atividade de splicing para um extrato nuclear empobrecido em U1, seria de grande interesse.