Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Este protocolo preenche uma lacuna técnica para o estudo bioquímico de C.elegans e expande sua utilidade como organismo modelo. Esta técnica é simples e robusta, permitindo o isolamento consistente do extrato nuclear C.elegans funcionalmente ativo. Comece colocando os animais L1 sincronizados em 10 150 milímetros de crescimento de mídia contendo placas contendo mídia semeadas com Escherichia coli OP50, e permita que os animais cresçam por 48 horas a 20 graus Celsius até chegarem ao estágio L4.

Uma vez preparados os tampões hipotônicos e hipertônicos, limpe o homogeneizador balch inundando a câmara de moagem com 70% de etanol. Em seguida, enxágue a câmara com água deionizada para remover o excesso de etanol. Insira a bola de carboneto de tungstênio na câmara de moagem.

Tampe as extremidades do cano do homogeneizador balch e fixe as tampas com os parafusos de polegar fornecidos. Em seguida, prepare cinco mililitros dos tampões hipotônicos e hipertônicos completos por amostra, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, encha uma seringa estéril de dois mililitros com um mililitro de tampão hipotônico completo, e lave suavemente a câmara de moagem do homogeneizador Balch, deixando aproximadamente 500 microliters de tampão hipotônico completo na câmara.

Armazene o homogeneizador lavado no gelo e deixe esfriar por 30 minutos. Colete os animais L4 bem alimentados com tampão M9 em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar os animais a 1.000 vezes g por três minutos. Remova o sobrenante e continue lavando a pelota animal até que o sobrenatante esteja limpo.

Em seguida, lave os animais com três mililitros de tampão hipotônico frio, e centrífuga novamente como demonstrado. Depois de remover o tampão hipotônico sobrenatante, adicione um mililitro de tampão hipotônico completo à pelota animal, e transfira a suspensão animal para uma nova seringa estéril de dois mililitros. Para homogeneizar os animais mantidos no gelo, empurre suavemente os animais através da câmara de moagem do homogeneizador Balch carregado com a bola de tungstênio.

Em seguida, recolham os animais de volta na seringa, e repitam este procedimento 30 vezes. Após 30 ciclos de homogeneização, colete a suspensão máxima animal do homogeneizador balch e armazene a seringa com a ponta posicionada para baixo dentro de um microtubo de 1,7 mililitro. Retire a bola de tungstênio e limpe a câmara de moagem com água deionizada.

Seque e devolva a bola ao respectivo tubo rotulado. Em seguida, insira a bola de tungstênio com 7,9880 milímetros de diâmetro e 12 micrômetros de distância na câmara de moagem e reseal o homogeneizador. Lave a câmara de moagem novamente com um mililitro de tampão hipotônico completo frio.

Triture a suspensão 25 vezes como demonstrado. Transfira a suspensão animal para um microtubo limpo de 1,7 mililitro e armazene a suspensão no gelo. Pelota para baixo os corpos animais e detritos por centrifugação.

Pipeta 40 microlitres do supernatante para um tubo rotulado como fração de entrada, e armazenar a fração no gelo. Transfira o restante do supernatante para um novo tubo de 1,7 mililitro sem perturbar a pelota e centrífuga para pelotas nos núcleos. Em seguida, transfira o supernante sem perturbar os núcleos de pelotização para um novo tubo de 1,7 mililitro rotulado como fração citosolítica.

Para lavar a pelota dos núcleos, adicione 500 microliters de tampão hipotônico completo à pelota, suspenda a pelota e centrífuga a 4.000 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. No final da centrifugação, resuspenja a pelota nuclear em 500 microliters de tampão hipotônico completo fresco, e novamente centrifugar a amostra como demonstrado. Em seguida, dissolva a pelota em 40 microliters de tampão hipertônico completo.

Transfira a suspensão nuclear para um novo tubo de 1,7 mililitro rotulado fração nuclear, e armazene-a no gelo. Determine a concentração proteica de três frações usando um kit de quantificação fluorescente. Alíquotar as frações nucleares em tubos de uso único contendo seis microgramas da proteína nuclear, e congelar em gelo seco e banho de etanol.

Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que use mais. A imagem representativa do gel mostra os produtos de transcrição de Caenorhabditis elegans L4 larvas extrato nuclear usando o modelo de DNA do promotor do CMV. O isolamento bem sucedido de proteínas nucleares ativas resultou em uma banda de 132 bases após uma transcrição in vitro, e o isolamento mal sucedido resultou em uma banda fraca ou na ausência de uma banda.

Lembre-se de rotular claramente os buffers completos. Tampões inapropriados podem prejudicar a funcionalidade das proteínas nucleares. Além disso, mantenha o gelo homogeneizador frio para evitar a desnaturação das proteínas.

O desenvolvimento dessa técnica permitiu aos pesquisadores medir a taxa de transcrição de RNA de C.elegans em condições estressantes, mostrando que a taxa de transcrição do animal pode mudar dependendo das condições ambientais.