Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro
11 de agosto de 2021
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar o extrato nuclear ativo do estágio 4 C. elegans larval e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro .
Este protocolo preenche uma lacuna técnica para o estudo bioquímico de C.elegans e expande sua utilidade como organismo modelo. Esta técnica é simples e robusta, permitindo o isolamento consistente do extrato nuclear C.elegans funcionalmente ativo. Comece colocando os animais L1 sincronizados em 10 150 milímetros de crescimento de mídia contendo placas contendo mídia semeadas com Escherichia coli OP50, e permita que os animais cresçam por 48 horas a 20 graus Celsius até chegarem ao estágio L4.
Uma vez preparados os tampões hipotônicos e hipertônicos, limpe o homogeneizador balch inundando a câmara de moagem com 70% de etanol. Em seguida, enxágue a câmara com água deionizada para remover o excesso de etanol. Insira a bola de carboneto de tungstênio na câmara de moagem.
Tampe as extremidades do cano do homogeneizador balch e fixe as tampas com os parafusos de polegar fornecidos. Em seguida, prepare cinco mililitros dos tampões hipotônicos e hipertônicos completos por amostra, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, encha uma seringa estéril de dois mililitros com um mililitro de tampão hipotônico completo, e lave suavemente a câmara de moagem do homogeneizador Balch, deixando aproximadamente 500 microliters de tampão hipotônico completo na câmara.
Armazene o homogeneizador lavado no gelo e deixe esfriar por 30 minutos. Colete os animais L4 bem alimentados com tampão M9 em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar os animais a 1.000 vezes g por três minutos. Remova o sobrenante e continue lavando a pelota animal até que o sobrenatante esteja limpo.
Em seguida, lave os animais com três mililitros de tampão hipotônico frio, e centrífuga novamente como demonstrado. Depois de remover o tampão hipotônico sobrenatante, adicione um mililitro de tampão hipotônico completo à pelota animal, e transfira a suspensão animal para uma nova seringa estéril de dois mililitros. Para homogeneizar os animais mantidos no gelo, empurre suavemente os animais através da câmara de moagem do homogeneizador Balch carregado com a bola de tungstênio.
Em seguida, recolham os animais de volta na seringa, e repitam este procedimento 30 vezes. Após 30 ciclos de homogeneização, colete a suspensão máxima animal do homogeneizador balch e armazene a seringa com a ponta posicionada para baixo dentro de um microtubo de 1,7 mililitro. Retire a bola de tungstênio e limpe a câmara de moagem com água deionizada.
Seque e devolva a bola ao respectivo tubo rotulado. Em seguida, insira a bola de tungstênio com 7,9880 milímetros de diâmetro e 12 micrômetros de distância na câmara de moagem e reseal o homogeneizador. Lave a câmara de moagem novamente com um mililitro de tampão hipotônico completo frio.
Triture a suspensão 25 vezes como demonstrado. Transfira a suspensão animal para um microtubo limpo de 1,7 mililitro e armazene a suspensão no gelo. Pelota para baixo os corpos animais e detritos por centrifugação.
Pipeta 40 microlitres do supernatante para um tubo rotulado como fração de entrada, e armazenar a fração no gelo. Transfira o restante do supernatante para um novo tubo de 1,7 mililitro sem perturbar a pelota e centrífuga para pelotas nos núcleos. Em seguida, transfira o supernante sem perturbar os núcleos de pelotização para um novo tubo de 1,7 mililitro rotulado como fração citosolítica.
Para lavar a pelota dos núcleos, adicione 500 microliters de tampão hipotônico completo à pelota, suspenda a pelota e centrífuga a 4.000 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. No final da centrifugação, resuspenja a pelota nuclear em 500 microliters de tampão hipotônico completo fresco, e novamente centrifugar a amostra como demonstrado. Em seguida, dissolva a pelota em 40 microliters de tampão hipertônico completo.
Transfira a suspensão nuclear para um novo tubo de 1,7 mililitro rotulado fração nuclear, e armazene-a no gelo. Determine a concentração proteica de três frações usando um kit de quantificação fluorescente. Alíquotar as frações nucleares em tubos de uso único contendo seis microgramas da proteína nuclear, e congelar em gelo seco e banho de etanol.
Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que use mais. A imagem representativa do gel mostra os produtos de transcrição de Caenorhabditis elegans L4 larvas extrato nuclear usando o modelo de DNA do promotor do CMV. O isolamento bem sucedido de proteínas nucleares ativas resultou em uma banda de 132 bases após uma transcrição in vitro, e o isolamento mal sucedido resultou em uma banda fraca ou na ausência de uma banda.
Lembre-se de rotular claramente os buffers completos. Tampões inapropriados podem prejudicar a funcionalidade das proteínas nucleares. Além disso, mantenha o gelo homogeneizador frio para evitar a desnaturação das proteínas.
O desenvolvimento dessa técnica permitiu aos pesquisadores medir a taxa de transcrição de RNA de C.elegans em condições estressantes, mostrando que a taxa de transcrição do animal pode mudar dependendo das condições ambientais.
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Visão Geral
Este protocolo preenche uma lacuna técnica para o estudo bioquímico de C. elegans e expande sua utilidade como um organismo modelo. Ele permite o isolamento consistente de extrato nuclear funcionalmente ativo de C. elegans e a visualização da atividade de transcrição em um sistema in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Neurociência
- Organismos Modelos
Fundamentos
- C. elegans é um organismo modelo amplamente utilizado na pesquisa biológica.
- Entender a atividade de transcrição é crucial para estudar a expressão gênica.
- Isolar extratos nucleares é essencial para vários ensaios bioquímicos.
- Este protocolo fornece um método confiável para obter extratos nucleares ativos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para isolar extratos nucleares ativos de C. elegans.
- Visualizar a atividade de transcrição in vitro.
- Aumentar a utilidade de C. elegans em estudos bioquímicos.
Métodos Utilizados
- C. elegans L1 sincronizados são cultivados em meio de crescimento de nematoides.
- Os animais são deixados se desenvolver até o estágio L4 a 20 graus Celsius.
- Os tampões são preparados para o processo de extração.
- Um homogenizador Balch é usado para o isolamento de extratos nucleares.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de extratos nucleares funcionalmente ativos.
- Visualização da atividade de transcrição em um sistema in vitro.
- Demonstração da robustez da técnica.
- Aplicações potenciais no estudo da regulação gênica.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para isolar extratos nucleares.
- Esta técnica aprimora o estudo bioquímico de C. elegans.
- Ela abre novas avenidas para pesquisa em expressão e regulação gênica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical technical gap in leveraging C. elegans for biochemical assays, enabling consistent isolation of functionally active nuclear extracts. By overcoming cuticle disruption challenges without compromising protein activity, it expands the utility of C. elegans in target validation and mechanistic studies. The method supports predictive confidence in gene regulation research through reliable in vitro transcription readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulation pathways in a genetically tractable model.
- Operational Value: Provides reproducible nuclear extract preparation for target de-risking.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing of gene function prior to mammalian model investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields quantitatively measurable transcription activity using defined DNA templates.
- Operational Value: Standardized fractionation workflow ensures batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Enables scalable assay development for compound effect screening on transcription.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking of targets via direct measurement of transcriptional output.
- Operational Value: Connects genetic perturbations to biochemical phenotypes in a whole-organism context.
- Strategic Value: Informs target selection by validating pathway relevance in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, providing biochemically validated nuclear extracts that bridge genetic findings to functional assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through direct transcription measurement.
- Screening: Enables assay readiness for evaluating modulator effects on gene expression.
- Analytics: Generates quantitative band intensity data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking nuclear extract activity to regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for nuclear extract preparation across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility in nuclear extract isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through reliable biochemical readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional transcriptional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans culture and biochemical fractionation techniques.
- Dependent on access to a Balch homogenizer and temperature-controlled centrifugation.
- Necessitates standardized buffer preparation and protein quantification protocols.
- Involves adaptation considerations for different developmental stages or mutant strains.
- Limited by the need for careful homogenizer maintenance to prevent cross-contamination.
