Name: Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a isolar extratos nucleares ativos de C. elegans e reconstituir a transcrição in vitro. Este protocolo simples e robusto utiliza homogeneizador de Balch para estudar regulação gênica em bioquímica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH MIRA (R35GM124678 a J. S.).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar o sistema de transcrição eucariótica devido à sua manutenção de baixo custo e à facilidade de manipulação genética. Aqui é descrito um protocolo para o isolamento consistente do extrato nuclear funcionalmente ativo de L4 C. elegans . Embora este protocolo tenha se concentrado em visualizar a atividade de transcrição, o cDNA produzido após a transcrição pode ser quantificado usando o RT-qPCR para obter uma medição mais precisa da atividade de <sup cl...

O pequeno nematode caenorhabditis elegans é um organismo modelo simples, mas poderoso, para abordar uma ampla gama de questões biológicas. Desde sua introdução em 1963, os nematoides têm sido inestimáveis para responder perguntas em neurobiologia, metabolismo, envelhecimento, desenvolvimento, imunidade e genética1. Algumas das muitas características do animal que o tornam um organismo modelo ideal incluem o curto tempo de geração, a eficácia da interferência do RNA, o corpo transparente e os mapas completos de sua linhagem celular e sistema nervoso.
Embora as contribuições do nematode para a ciência sejam vastas, elas têm sido subutilizados para elucidar o sistema de transcrição eucariótica, com a maioria de nosso entendimento sobre esses mecanismos provenientes de estudos que usam extrato nuclear de levedura, mosca-das-frutas e cultura celular de mamíferos2. O maior obstáculo que dissuade os pesquisadores de extrair extrato nuclear funcional é a dura cutícula externa do nematode. Este exoesqueleto compreende collagens transversais, cuticlins, glicoproteínas e lipídios, tornando C. elegans do estágio larval à idade adulta resistente à extração de proteínas através de forças químicas ou mecânicas3. Um sistema de transcrição in vitro usando extrato nuclear C. elegans já foi desenvolvido, mas não amplamente adotado devido ao escopo limitado do sistema, e o uso de homogeneizador Dounce para a preparação do extrato poderia levar à instabilidade proteica4,5.
Ao contrário do protocolo anterior para isolamento de extrato nuclear que utilizava um homogeneizador do Dounce para quebrar C. elegans, este protocolo usa um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch consiste em dois componentes principais: uma bola de carboneto de tungstênio e um bloco de aço inoxidável com um canal entediado de uma extremidade para outra. O homogeneizador Balch é carregado com a bola de carboneto de tungstênio e tampado em ambos os lados para selar a câmara de moagem. As seringas podem ser carregadas nas duas portas verticais que levam à câmara de moagem. À medida que o material é passado de uma seringa para a outra através da câmara de moagem, a pressão das seringas força o material através de uma estreita distância entre a bola e a parede da câmara. Esta pressão lenta e constante quebra o material até atingir um tamanho consistente que é capaz de passar pela estreita lacuna facilmente. Forçando C. elegans através da estreita lacuna através de uma pressão constante, mas suave, quebra os animais abertos, liberando seu conteúdo no buffer circundante. A troca de tamanhos de esfera aperta ainda mais a lacuna, quebrando as células recém-liberadas e libera os núcleos para o buffer. Vários casos de centrifugação separam os núcleos do resto dos detritos celulares, permitindo a coleta de um extrato nuclear limpo. O homogeneizador Balch é preferido em vez do homogeneizador do Dounce por várias razões: o sistema pode lidar com um grande número de animais, possibilitando extrair uma alta quantidade de proteínas ativas em uma única tentativa; a usinagem precisa das bolas e do bloco de aço permite uma moagem consistente entre múltiplas amostras; o bloco de aço pesado age como um dissipador de calor, afastando uniformemente o calor da câmara de moagem, impedindo a desnaturação.
Após o isolamento, a atividade transcricional do extrato nuclear deve ser verificada antes de ser usada em qualquer experimento bioquímico. Tradicionalmente, a atividade de transcrição era medida usando nucleotídeos radiolabelados para rastrear e visualizar o RNA recém-sintetizado. No entanto, a rotulagem radioativa pode ser pesada, pois requer precaução durante o uso e descarte6. Os avanços tecnológicos permitem que os pesquisadores de hoje usem métodos muito menos prejudiciais ou problemáticos para medir até mesmo pequenas quantidades de RNA usando técnicas como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)7. Aqui, o protocolo descreve um método para isolar o extrato nuclear ativo do estágio larval 4 (L4) C. elegans e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro.

<table><tbody><tr><td><forte>Consumíveis e reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,2 mL Tubos de 8 tiras e Tampas de Tira Plana, Transparente</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR individuais de 0,2 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microtubos estéreis</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol de grau molecular absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 10 mL</td><td>VWR internacional</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 150 mm</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>Seringas plásticas de 20 mL</td><td>Seringas Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject de 2 mL</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>Copo de filtro de vácuo de 500 mL 0,22 &micro; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga cônicos de 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 50 mL</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica de 5 mL</td><td>VWR internacional</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Criterion</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Marcador à prova de álcool</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Dicloreto de cálcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>Controle DNA templos clonagem primers, para a frente 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controle de primers de clonagem de templos de DNA, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td>deionizada</tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de DNA gel, seguro para SYBR</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de escada de DNA, O' régua genética</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Carregamento de DNA, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNase, Baseline-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>Gelo</td><td></td><td></td><td></td> seco</tr><tr><td>Escherichia coli OP50 cepa</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>HeLa extrato nuclear in vitro sistema de transcrição, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Solução Hepes, 1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico 37%</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante de hipoclorito</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>Dicloreto de magnésio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de pesagem média</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>água de grau molecular, Hypure</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Nistatina</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; Sistema de PCR N1638</td><td></td></tr><tr><td>, FailSafe com pré-mistura A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease, Halt coquetel de uso único 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensaio de proteína, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Kit de transcrição reversa Q33211</td><td></td></tr><tr><td>, Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>kit de extração de RNA RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Inhibitor Applied Biosystems</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril com 0.2 &micro; m Membrana de polietersulfona</td><td>VWR international</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>primers de transcrição, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>primers de transcrição, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; C incubadora</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg; C incubadora</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C incubadora</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; Geladeira C</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C freezer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch homogeneizador, homogeneizador de células isobiotec</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, Eppendorf 5418 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>Microscópio de dissecção 82013-800</td><td></td></tr><tr><td>, Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro, Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel, iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífugas, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta L-10 XLS+, pipeta Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>L-200 XLS+, pipeta Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>plataforma de balanço</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento da caenorhabditis ativa elegans extrato nuclear e reconstituição para transcrição in vitro

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans tem sido um importante sistema modelo de pesquisa biológica desde que foi introduzido em 1963. No entanto, C. elegans não foi totalmente utilizado no estudo bioquímico de reações biológicas usando seus extratos nucleares, como transcrição in vitro e replicação de DNA. Um obstáculo significativo para o uso de C. elegans em estudos bioquímicos é interromper a grossa cutícula externa do nematoide sem sacrificar a atividade do extrato nuclear. Embora vários métodos sejam usados para quebrar a cutícula, como homogeneização de Dounce ou sonicação, eles muitas vezes levam à instabilidade proteica. Não há protocolos estabelecidos para isolar proteínas nucleares ativas de larvas ou adultos C. elegans para reações in vitro . Aqui, o protocolo descreve detalhadamente a homogeneização do estágio larval 4 C. elegans utilizando um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch usa pressão para forçar lentamente os animais através de uma estreita abertura quebrando a cutícula no processo. O design uniforme e a usinagem precisa do homogeneizador Balch permitem uma moagem consistente de animais entre experimentos. Fracionar o homogeneizador obtido a partir do homogeneizador Balch produz extrato nuclear funcionalmente ativo que pode ser usado em um método in vitro para avaliar a atividade de transcrição de C. elegans.

Seguindo as etapas descritas deve produzir extrato nuclear funcional (Figura 1), o desvio nas etapas de moagem ou lavagem pode levar a má atividade ou baixos rendimentos. Se o extrato nuclear C. elegans funcional for obtido, ele transcreverá a região a jusante do promotor do CMV no modelo de DNA quando adicionado ao ensaio in vitro descrito anteriormente. A transcrição resultante do RNA pode ser purificada a partir das proteínas nucleares e...

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar o extrato nuclear ativo do estágio 4 C. elegans larval e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro .

Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Este protocolo preenche uma lacuna técnica para o estudo bioquímico de C.elegans e expande sua utilidade como organismo modelo. Esta técnica é simples e robusta, permitindo o isolamento consistente do extrato nuclear C.elegans funcionalmente ativo. Comece colocando os animais L1 sincronizados em 10 150 milímetros de crescimento de mídia contendo placas contendo mídia semeadas com Escherichia coli OP50, e permita que os animais cresçam por 48 horas a 20 graus Celsius até chegarem ao estágio L4.Uma vez preparados os tampões hipotônicos e hipertônicos, limpe o homogeneizador balch inundando a câmara de moagem com 70% de etanol. Em seguida, enxágue a câmara com água deionizada para remover o excesso de etanol. Insira a bola de carboneto de tungstênio na câmara de moagem.Tampe as extremidades do cano do homogeneizador balch e fixe as tampas com os parafusos de polegar fornecidos. Em seguida, prepare cinco mililitros dos tampões hipotônicos e hipertônicos completos por amostra, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, encha uma seringa estéril de dois mililitros com um mililitro de tampão hipotônico completo, e lave suavemente a câmara de moagem do homogeneizador Balch, deixando aproximadamente 500 microliters de tampão hipotônico completo na câmara.Armazene o homogeneizador lavado no gelo e deixe esfriar por 30 minutos. Colete os animais L4 bem alimentados com tampão M9 em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar os animais a 1.000 vezes g por três minutos. Remova o sobrenante e continue lavando a pelota animal até que o sobrenatante esteja limpo.Em seguida, lave os animais com três mililitros de tampão hipotônico frio, e centrífuga novamente como demonstrado. Depois de remover o tampão hipotônico sobrenatante, adicione um mililitro de tampão hipotônico completo à pelota animal, e transfira a suspensão animal para uma nova seringa estéril de dois mililitros. Para homogeneizar os animais mantidos no gelo, empurre suavemente os animais através da câmara de moagem do homogeneizador Balch carregado com a bola de tungstênio.Em seguida, recolham os animais de volta na seringa, e repitam este procedimento 30 vezes. Após 30 ciclos de homogeneização, colete a suspensão máxima animal do homogeneizador balch e armazene a seringa com a ponta posicionada para baixo dentro de um microtubo de 1,7 mililitro. Retire a bola de tungstênio e limpe a câmara de moagem com água deionizada.Seque e devolva a bola ao respectivo tubo rotulado. Em seguida, insira a bola de tungstênio com 7,9880 milímetros de diâmetro e 12 micrômetros de distância na câmara de moagem e reseal o homogeneizador. Lave a câmara de moagem novamente com um mililitro de tampão hipotônico completo frio.Triture a suspensão 25 vezes como demonstrado. Transfira a suspensão animal para um microtubo limpo de 1,7 mililitro e armazene a suspensão no gelo. Pelota para baixo os corpos animais e detritos por centrifugação.Pipeta 40 microlitres do supernatante para um tubo rotulado como fração de entrada, e armazenar a fração no gelo. Transfira o restante do supernatante para um novo tubo de 1,7 mililitro sem perturbar a pelota e centrífuga para pelotas nos núcleos. Em seguida, transfira o supernante sem perturbar os núcleos de pelotização para um novo tubo de 1,7 mililitro rotulado como fração citosolítica.Para lavar a pelota dos núcleos, adicione 500 microliters de tampão hipotônico completo à pelota, suspenda a pelota e centrífuga a 4.000 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. No final da centrifugação, resuspenja a pelota nuclear em 500 microliters de tampão hipotônico completo fresco, e novamente centrifugar a amostra como demonstrado. Em seguida, dissolva a pelota em 40 microliters de tampão hipertônico completo.Transfira a suspensão nuclear para um novo tubo de 1,7 mililitro rotulado fração nuclear, e armazene-a no gelo. Determine a concentração proteica de três frações usando um kit de quantificação fluorescente. Alíquotar as frações nucleares em tubos de uso único contendo seis microgramas da proteína nuclear, e congelar em gelo seco e banho de etanol.Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que use mais. A imagem representativa do gel mostra os produtos de transcrição de Caenorhabditis elegans L4 larvas extrato nuclear usando o modelo de DNA do promotor do CMV. O isolamento bem sucedido de proteínas nucleares ativas resultou em uma banda de 132 bases após uma transcrição in vitro, e o isolamento mal sucedido resultou em uma banda fraca ou na ausência de uma banda.Lembre-se de rotular claramente os buffers completos. Tampões inapropriados podem prejudicar a funcionalidade das proteínas nucleares. Além disso, mantenha o gelo homogeneizador frio para evitar a desnaturação das proteínas.O desenvolvimento dessa técnica permitiu aos pesquisadores medir a taxa de transcrição de RNA de C.elegans em condições estressantes, mostrando que a taxa de transcrição do animal pode mudar dependendo das condições ambientais.

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo para isolar e ativando espermátides de...

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Este protocolo descreve a preparação de um substrato sintético para o...

Ensaio in vitro de metilação tRNA com a Entamoeba histolytica DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferase (Ehmeth) Enzyme

Análise de microarrays foi conduzido para determinar perfis de expressão genética...

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Aqui apresentamos um protocolo para analisar as interações RNA/proteína. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) é baseado na migração diferencial de complexos de RNA/proteína e RNA livre durante a eletroforese em gel nativo. Usando uma sonda de RNA radiomarcada, os complexos RNA/proteína podem ser visualizados por autorradiografia.

Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Este protocolo descreve como estudar processos celulares durante a conversão de destino célula em Caenorhabditis elegans in vivo. Usar animais transgénicos, permitindo que o calor-choque orientada por promotor superexpressão do factor de transcrição destino indutor de neurônio-1 e mediada por RNAi depleção da cromatina-regulação fator LIN-53 células germinativas para reprogramação do neurônio pode ser observado na vivo.<br...

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do RNA, DNA e proteínas da mesma amostra, em um esforço para reduzir a variação, melhorar a reprodutibilidade e facilitar interpretações.

Combinado nucleotídeos e proteínas extrações em Caenorhabditis elegans

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

Este método descreve um protocolo para a preparação de extratos de proteína de alto rendimento de amostras de elegans de Caenorhabditis e posterior co-imunoprecipitação.

Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.

Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

O presente protocolo descreve métodos de suplementação lipídica em culturas líquidas e a placas para Caenorhabditis elegans, juntamente com estudos longitudinais e análise transcricional gênica a granel ou de alguns vermes e tecidos de vermes.

Suplementação lipídica para longevidade e análise transcricional gênica em Caenorhabditis elegans

Aprenda a isolar extratos nucleares ativos de C. elegans e reconstituir a transcrição in vitro. Este protocolo simples e robusto utiliza homogeneizador de Balch para estudar regulação gênica em bioquímica.

Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Explorar mais vídeos