Name: Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a preservar peptídeos endógenos por inativação térmica de proteases e quantificação relativa com marcação isotópica para estudos de peptidômica. Este método utiliza reagentes comerciais acessíveis.

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O desenvolvimento e o uso das técnicas aqui descritas foram apoiados pelo Conselho Nacional de Pesquisa 420811/2018-4 (LMC); A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) concede 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) e 21/01286-1 (MEME). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do artigo.

O procedimento a seguir para extração de peptídeos e metilação redutiva foi adaptado de procedimentos publicados anteriormente24,25,26,27. Esse protocolo seguiu as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e foi aprovado pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) do Instituto de Biociências da Universidade estadual de São Paulo. As etapas do protocolo são mostradas na Figura 1.
NOTA: Prepare todas as soluções aquosas em água ultrauso.
1. Extração de peptídeo
<ol><li>Cultura celular<ol>
<li>Cultivar células SHSY5Y em um prato de 15 cm a 37 °C abaixo de 5% de CO2 no meio modificado da Águia de Dulbecco contendo 15% de soro bovino fetal e 1% penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Use 2-3 placas para cada amostra. Aumentar as células para 100% confluência.</li>
		<li>Após o tratamento pretendido, lave as células duas vezes com soro fisiológico tamponado por fosfato. Em seguida, adicione 10 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato, raspe as células e colete em um tubo de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 800 x g por 5 min e remover o supernatante. Resuspenda a pelota em 1 mL de água deionizada ultra-purificada a 80 °C.</li>
		<li>Transfira o conteúdo do tubo (lisecelular) para um tubo de microfuça de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tecidos animais (principalmente tecido nervoso):<ol>
<li>Anestesiar o adulto macho danio rerio (zebrafish) com uma dose letal de MS 222 (100 mg/L) e submetê-lo imediatamente a 8 s de radiação de micro-ondas para inativar peptidase e protease. NOTA: Pode-se usar um forno de micro-ondas do tipo doméstico. Um micro-ondas de 900 W foi usado para 8 a 10 s em potência total. O micro-ondas utilizado deve ser capaz de elevar a temperatura cerebral para &gt; 80 °C dentro de 10 s. A reprodutibilidade no aquecimento entre as amostras também seria beneficiada colocando o tecido no mesmo local no micro-ondas.</li>
		<li>Após a inativação do calor, colete todo o cérebro em um tubo de microfuça de 2 mL e congele a −80 °C até a análise.</li>
		<li>Resuspenda a amostra de tecido em 1 mL de água deionizada ultra-purificada a 80 °C. Sonicar o tecido com uma sonda usando 30 pulsos (4 Hz) de 1 s. NOTAs: Para tecidos hepáticos e renais, use um homogeneizador mecânico a 10.000-30.000 rpm para 20 s. Para tecidos musculares, triture o tecido em nitrogênio líquido usando um cadinho de porcelana e pilão. As etapas a seguir são as mesmas para o liseto celular ou o tecido homogeneizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar o tecido de lise celular ou homogeneizar a 80 °C por 20 min. Em seguida, esfrie no gelo por 10-30 min.</li>
	<li>Adicione 10 μL de solução de estoque de 1 M HCl para cada 1 mL de volume amostral para obter uma concentração final de 10 mM. Misture por vórtice por 20 s e incuba ainda mais no gelo por 15 minutos. NOTA: Antes de acidificar, certifique-se de que a amostra esteja completamente resfriada para evitar quebrar as ligações de peptídeos causadas pela acidificação a temperaturas elevadas.</li>
	<li>Centrifugar o lisecelular ou o tecido homogeneado a 12.000 x g a 4 °C por 15 min. Colete o supernatante em tubos de microcentrifuuge de proteína de baixa ligação e armazene-o a -80 °C.</li>
	<li>Limpe os dispositivos de ultrafiltração (filtros de corte de 10 kDa) adicionando água e centrífuga a 2300 x g por 3 min. Repita este passo mais duas vezes.</li>
	<li>Coloque o supernatante nos filtros de corte pré-lavados de 10 kDa e centrífuga a 2.300 x g a 4 °C por 50 min em uma centrífuga rereto. O fluxo representa o extrato de peptídeo.</li>
	<li>Desalte as amostras em colunas de limpeza de fase invertida de acordo com as instruções do fabricante usando soluções de acetonitrilo (ACN) e ácido trifluoroacético (TFA), conforme descrito abaixo:<ol>
<li>Equilibre a coluna com 1 mL de 100% ACN.</li>
		<li>Lave a coluna com solução de 1 mL de 5% ACN com 0,1% de TFA.</li>
		<li>Carregue o volume completo da amostra na coluna.</li>
		<li>Lave a coluna com solução de 1 mL de 5% DE ACN com 0,1% de TFA</li>
		<li>Elute os peptídeos da coluna com uma solução de 1,8 mL de 100% ACN com 0,15% TFA em tubos de microcentrifuge de baixa ligação de proteína.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seque a amostra completamente em uma centrífuga de vácuo. Defina o método de concentração para solventes orgânicos e temperatura a 30 °C. O tempo de concentração é monitorado em exibição.<ol>
<li>Armazene as amostras a −80°C até o próximo passo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Quantificação de peptídeo com fluorescamina
NOTA: A quantidade de peptídeo pode ser estimada usando fluorescamina no pH 6.8 como descrito anteriormente11,28. Este método consiste na fixação de uma molécula de fluorescamina às aminas primárias presentes nos resíduos de lise (K) e/ou no terminal N de peptídeos. A reação é realizada no pH 6.8 para garantir que a fluorescamina reaja apenas com os grupos amino dos peptídeos e não com aminoácidos livres. A fluorescamina é medida usando um espectrofluorômetro em um comprimento de onda de excitação de 370 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm.
<ol><li>Prepare diferentes concentrações do peptídeo padrão (0,05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 e 0,7 μg/μL) e armazene as alíquotas a -20 °C. NOTA: O peptídeo 5A (LTLRTKL) é sugerido, uma vez que possui uma composição e concentração conhecidas.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque de fluorescamina (0,3 mg/mL) em acetona. Alíquotar rapidamente em tubos de microcentrifuuge (1 mL), vedação usando parafilme e armazenar a -20 °C no escuro.</li>
	<li>Prepare 0,2 M Tampão fosfato (PB) em pH 6.8. NOTA: Prepare 0,2 M PB adicionando 0,1 M tampão de fosfato pH 6.8 (26,85 mL de Na2HPO3 1M) e 0,1 M tampão fosfato pH 6.8 (23,15 mL de NaH2PO3 1M) a 250 mL de água</li>
	<li>Resuspende as amostras de peptídeos em 100-200 μL de água ultra-purificada.</li>
	<li>Pipeta 2,5 μL das concentrações de peptídeos padrão e amostras na placa branca de 96 poços para ensaios de fluorescência em triplicado. Adicione 25 μL de tampão fosfato de 0,2 M.</li>
	<li>Adicione 12,5 μL de fluorescamina com uma pipeta multicanal. Homogeneize suavemente por 1 min no agitador rotador orbital.</li>
	<li>Em seguida, adicione 110 μL de água com uma pipeta multicanal para parar a reação. NOTA: Transfira a solução de estoque de fluorescamina e a água ultrauso para dois reservatórios para pipetar essas soluções com uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Ajuste os seguintes parâmetros de leitura no espectrofluorômetro: Leia as amostras do topo, comprimento de onda de excitação a 370 nm e comprimento de onda de emissão a 480 nm.</li>
	<li>Leia a placa no espectrômetro.</li>
</ol>3. Metilação redutiva da rotulagem de aminas
NOTA: Este método de rotulagem isotópica baseia-se na dimetilação de grupos de amina com formas deutadas e não deutadas de reagentes de formaldeído e cianoboroidride de sódio. O produto final desta reação adiciona 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da ou 36 Da à massa final de cada peptídeo em cada local de rotulagem disponível (lysine ou N-terminal). Esta reação produz uma diferença m/z nos peptídeos rotulados com diferentes formas observadas no espectro MS (Tabela 1).
ATENÇÃO: Os equipamentos de segurança adequados devem ser usados para manusear esses compostos, e devem ser tomados cuidados para minimizar a exposição. Procedimentos com reagentes de formaldeído e cianoboroidride de sódio devem ser realizados em um capô de fumaça porque são muito tóxicos (incluindo a pesagem do cianoboroidride de sódio). Durante a reação de sacieda e acidificação, um gás tóxico (cianeto de hidrogênio) pode ser gerado.
<ol><li>Prepare as seguintes soluções frescas do estoque ou reagentes no dia do procedimento em água ultrauso:<ol>
<li>Diluir o estoque de 37% de Formaldeído (CH2O) para 4%.</li>
		<li>Diluir o estoque de 20% de Deuterado de Formaldeído (CD2O) para 4%.</li>
		<li>Diluir o estoque de 20 % Deuterated C13 Formaldeído (13CD2O) para 4%.</li>
		<li>Prepare 0,6 m NaBH3CN.</li>
		<li>Prepare-se 0,6 m naBd3Cn.</li>
		<li>Prepare uma solução de 1% de bicarbonato de amônio.</li>
		<li>Prepare uma solução 5% de ácido fórmico. NOTA: Quanto à quantitação relativa dos peptídeos, uma vez que diferentes esquemas experimentais podem ser realizados dependendo do número de rótulos utilizados, é necessário atenção durante o procedimento de rotulagem química. Recomenda-se separar pequenas alíquotas dos rótulos em racks separados com as respectivas amostras a serem rotuladas para reduzir o potencial de erro humano na adição do reagente errado aos tubos de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare cada amostra contendo até 25 μg do peptídeo. As amostras não devem conter Tris ou Amônio Bicarbonato. NOTA: As quantidades descritas abaixo são suficientes para cada amostra em um volume de 100 μL. Prossiga com as etapas 3.3-3.8 em um capô de fumaça.</li>
	<li>Adicione 1/10º volume de 1 M TEAB às amostras (concentração final da solução 100 mM de TEAB). Verifique o pH com um papel indicador de pH; deve ser entre 5-8. Ajuste com HCl ou NaOH, se necessário.</li>
	<li>Adicione 4 μL de Formaldeído deuterado ou Formaldeído deuterado C13 de acordo com o esquema de rotulagem estabelecido. Misture por 5 s por vórtice.</li>
	<li>Adicione 4 μL de NaBH3CN (0,6 M) ou NaBD3CN (0,6 M) de acordo com o esquema de rotulagem estabelecido. Misture por 5 s por vórtice.</li>
	<li>Incubar em um capô de fumaça por 2 h à temperatura ambiente, misturando a cada 30 minutos.</li>
	<li>Repita as etapas 3.4 e 3.5. Incubar as amostras em um capô de fumaça durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 16 μL de bicarbonato de amônio (1%) e misture por vórtice. Coloque a amostra no gelo, adicione 8 μL de ácido fórmico (5%), e misture por vórtice para 5 s.</li>
	<li>Combine as amostras, ajuste o pH para 2-4 e desalva as amostras combinadas em colunas de limpeza de fase invertida, conforme descrito anteriormente na etapa 1.8.</li>
	<li>Seque a amostra completamente em uma centrífuga de vácuo. Defina o método de concentração para solventes orgânicos e temperatura a 30 °C. O tempo de concentração é monitorado em exibição.</li>
	<li>Armazene as amostras a -20 °C.</li>
</ol>4. Cromatografia líquida e espectrometria de massa
<ol><li>Execute a análise LC-MS usando um sistema nanoHPLC acoplado a um instrumento MS compatível com etiquetas de metila. NOTA: Uma variedade de instrumentos ms são compatíveis com a rotulagem RMA. Um sistema nanoHPLC acoplado ao Orbitrap é normalmente usado para realizar análises de LC-MS através de uma fonte de íon nanoeletríspray. Primeiro, a amostra é carregada em um pré-lombar e peptídeos separados em uma coluna analítica. A elução de peptídeos é realizada utilizando um gradiente linear de 5%-45% de acetonitrilo, em ácido fórmico de 0,1%, durante 90 min, com um fluxo de 200 nL/min. O espectrômetro de massa é definido para funcionar no modo dependente de dados. Cada varredura completa é adquirida a uma intensidade de 10-30 eV, 2,3 Kv, e então os dez picos mais altos são selecionados para a dissociação induzida por colisão (CID). O tempo de injeção é definido na armadilha de íons a 100 ms, e a injeção Fourier Transform (FT)-MS é fixada com uma resolução de 1000 ms 30.000 a m/z 300-1800. Um mínimo de 5000 contagens e uma exclusão dinâmica de 70 s é usado para realizar a varredura de fragmentação.</li>
</ol>5. Quantitação relativa de peptídeos
NOTA: Os espectros ms são analisados no software do espectrômetro de massa. Grupos de pico de peptídeos rotulados com diferentes tags são identificados no espectro de MS. A quantitação relativa é calculada pela intensidade de cada pico monoisotópico. Cada grupo tratado é comparado ao respectivo grupo controle.
<ol><li>Clique duplo direito no arquivo de amostra bruta para abrir o software de análise de espectro. Carregue os cromatogramas de tempo de retenção (RT) e MS (EM) em duas guias, superior e inferior, respectivamente.</li>
	<li>Clique com o botão direito de clicar uma vez sequencialmente nos ícones de opções Display e Mass na barra de ferramentas do software e definir a precisão de massa para quatro decimais.</li>
	<li>Posicione o cursor do mouse em qualquer lugar da guia RT. Procure o tempo de retenção do íon correspondente a ser analisado e clique no botão direito do mouse. O espectro MS do tempo selecionado será mostrado automaticamente na guia EM.</li>
	<li>Posicione o cursor do mouse em qualquer lugar da guia EM. Procure os íons a serem analisados.</li>
	<li>Clique direito e segure-se em uma região adjacente à esquerda perto desses íons. Em seguida, arraste o mouse para a direita na faixa desejada para ampliar a região de interesse.</li>
	<li>Mantenha o mouse posicionado na guia EM e clique nas setas do teclado direito ou esquerdo para definir a faixa de íons a serem analisados.</li>
	<li>Posicione o cursor do mouse novamente no início do intervalo de tempo desejado.</li>
	<li>Clique com o botão direito do mouse e arraste o mouse até o valor da hora escolhida. Deixe o botão. A intensidade acumulada dos íons será mostrada automaticamente na guia EM.</li>
	<li>Colete os dados de intensidade de íons, m/z e íons em uma planilha. NOTA: A massa monoisotópica de cada peptídeo sem adição de grupos de metila é calculada a partir da seguinte fórmula: Peptídeo não modificado em massa = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z) m/zais a massa observada para cobrar valor para o pico monoisotópico para cada peptídeo rotulado com diferentes combinações de tags (a =1, 2, 3, 4 ou 5, correspondente ao número da amostra). z é estado de carga. Ca é a massa monoisotópica de um par de grupos de metila: Para a=1, Ca = 28,0313 (a adição líquida de dois grupos CH3 à amina primária) Para a=2, Ca = 30,0439 para dois grupos CHD2 Para a=3, Ca = 32,0564 para dois grupos CD2H Para a=4, Ca= 34,0690 para dois grupos CD3 Para a=5, Ca = 36,0757 para dois 13 grupos CD3 T é o número de pares de grupos de metila incorporados no peptídeo. Isso pode ser calculado a partir da seguinte fórmula quando cinco tags são usadas: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. Para peptídeos que contêm uma única amina primária e, portanto, são rotulados com apenas dois grupos de metila apresentam sobreposições de pico no espectro de MS quando são usadas etiquetas adjacentes. O pico de intensidade de cada peptídeo rotulado pode ser corrigido usando as equações descritas por Tashima e Fricker25.</li>
</ol>6. Identificação de Peptídeos
<ol><li>Para identificar peptídeos, analise os dados de MS/MS usando um mecanismo de pesquisa de banco de dados29,30.</li>
	<li>Para calcular a taxa de descoberta falsa (FDR) usando o método de fusão de isca, pesquise um banco de dados de isca. NOTA: Os parâmetros de pesquisa geralmente utilizados não são especificidade de enzimas; tolerância de massa precursora definida de 15-50 ppm; tolerância de massa de íons fragmentado de 0,5 Da; modificações variáveis: aminas reativas de resíduos de Lys e N-terminus dos rótulos metilados isotópicos de peptídeos (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+30 32), L4 (+34) e L5 (+36)), metionina oxidada (+15,99 Da) e acetilação (+42,01 Da).</li>
	<li>Em seguida, classifique os peptídeos pela sua média de confiança local para selecionar os melhores espectros para anotar e filtrar por FDR ≤5%.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62971/62971fig01.jpg"> Figura 1: Estudos peptidômicos do fluxo de trabalho. Etapas de extração de peptídeos e Metilação Redutiva de aminas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62971/62971fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Não existem interesses financeiros concorrentes.

Na maioria dos estudos de peptidóticos, um dos passos críticos é, sem dúvida, a preparação da amostra que deve ser cuidadosamente realizada para evitar a presença de fragmentos de peptídeos gerados por proteases após alguns minutos após a morte. Os estudos iniciais sobre extratos cerebrais preparados a partir de amostras não micro-ondas mostraram um grande número de fragmentos de proteínas presentes nos microfiltratos de 10 kDa. Diferentes abordagens foram descritas para evitar espectros de peptídeos da degradação protei...

As ciências "omics" são caracterizadas pela análise profunda de um conjunto de moléculas, como DNA, RNA, proteínas, peptídeos, metabólitos, etc. Estes conjuntos de dados gerados em larga escala (genômica, transcriômica, proteômica, peptidômica, metabolômica, etc.) revolucionaram a biologia e levaram a uma compreensão avançada dos processos biológicos1. O termo peptidomia começou a ser introduzido no início do século XX, e alguns autores se referem a ele como um ramo da proteômica2. No entanto, a peptidômica possui particularidades distintas, onde o principal interesse é investigar o conteúdo de peptídeos gerados naturalmente durante os processos celulares, bem como a caracterização da atividade biológica dessas moléculas3,4.
Inicialmente, os estudos de peptídeos bioativos eram restritos aos neuropeptídeos e peptídeos hormonais através da degradação de Edman e radioimunessay. No entanto, essas técnicas não permitem uma análise global, dependendo do isolamento de cada peptídeo em altas concentrações, tempo para a geração de anticorpos, além da possibilidade de reatividade cruzada5.
A análise da peptidomia só foi possível após vários avanços na cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa (LC-MS) e projetos de genoma que forneceram pools de dados abrangentes para estudos proteômicos/peptidóticos6,7. Além disso, um protocolo específico de extração de peptídeos para peptidomes precisava ser estabelecido porque os primeiros estudos que analisaram neuropeptídeos globalmente em amostras cerebrais mostraram que a detecção foi afetada pela degradação maciça de proteínas, que ocorrem principalmente neste tecido após 1 min após a morte. A presença desses fragmentos de peptídeo mascarava o sinal de neuropeptídeo e não representava o peptidome in vivo. Esse problema foi resolvido principalmente com a aplicação de inativação de aquecimento rápido de proteases usando irradiação de micro-ondas, o que reduziu drasticamente a presença desses fragmentos de artefato e permitiu não apenas a identificação de fragmentos de neuropeptídeos, mas revelou a presença de um conjunto de peptídeos de proteínas citostómicas, mitocondriais e nucleares, diferentes de degradação6,8,9.
Esses procedimentos metodológicos permitiram uma expansão do peptidome para além dos conhecidos neuropeptídeos, onde centenas de peptídeos intracelulares gerados principalmente pela ação de proteasomes foram identificados em leveduras10, zebrafish11, tecidos de roedores12 e células humanas13. Dezenas desses peptídeos intracelulares têm sido extensivamente mostrados com atividades biológicas e farmacológicas14,15. Além disso, esses peptídeos podem ser usados como biomarcadores de doenças e possivelmente ter significância clínica, como demonstrado no fluido cefalorraquidiano de pacientes com aneurisma saccular intracraniano16.
Atualmente, além da identificação de sequências de peptídeos, é possível através da espectrometria de massa obter dados de quantitação absoluta e relativa. Na quantitação absoluta, os níveis de peptídeos em uma amostra biológica são comparados aos padrões sintéticos, enquanto na quantitação relativa, os níveis de peptídeos são comparados entre duas ou mais amostras17. A quantitação relativa pode ser realizada utilizando as seguintes abordagens: 1) "livre de rótulos"18; 2) rotulagem metabólica in vivo ou 3) rotulagem química. Os dois últimos baseiam-se no uso de formas isotópicas estáveis incorporadas em peptídeos19,20. Na análise sem rótulos, os níveis de peptídeos são estimados considerando a força do sinal (contagem espectral) durante o LC-MS18. No entanto, a rotulagem isotópica pode obter níveis relativos mais precisos de peptídeos.
Muitos estudos peptidômicos utilizaram butiratrato de trimetilamônio (TMAB) rotulando reagentes como rotulagem química, e mais recentemente, a metilação redutiva de Aminas (RMA) com formas deutadas e não deuteradas de reagentes de formaldeído e cianoboroiddeto de sódio foram usados11,21,22. No entanto, os rótulos TMAB não estão disponíveis comercialmente, e o processo de síntese é muito trabalhoso. Por outro lado, na RMA, os reagentes estão disponíveis comercialmente, baratos em comparação com outros rótulos, o procedimento é simples de realizar, e os peptídeos rotulados são estáveis23,24.
O uso de RMA envolve a formação de uma base de Schiff permitindo que os peptídeos reajam com formaldeído, seguido de uma reação de redução através do cianoboroidido. Esta reação causa dimetilação de grupos de amino livres em terminais N e cadeias laterais de lise e monometilados N-terminais prolines. Como os resíduos de prolina são muitas vezes raros no terminal N, praticamente todos os peptídeos com aminas gratuitas no n-terminus são rotulados com dois grupos de metila23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Filtros de corte de 10 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10</td></tr><tr><td>kDa Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11213</td><td></td></tr><tr><td>coluna analítica (EASY-Column)</td><td>EASY-Column</td><td>(SC200)</td><td>&nbsp; 10 cm, ID75 &micro; m, 3 e micro; m, C18-A2</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Fluoresamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído-13C, d2, solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>596388</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído-d2 solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>Hotte</td><td>Quimis</td><td>Q216</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico - HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de retenção LoBind-Protein</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108116-100EA</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ Velos</td><td></td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Panasonic</td><td>NN-ST67HSRU</td><td></td></tr><tr><td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC140</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions Inc.</td><td>VERSÃO 8.5</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>3002</td><td>comprimidos</td></tr><tr><td>pré-coluna (EASY-Column)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>(SC001)</td><td>2 cm, ID100 &micro; m, 5 e micro; m, C18-A1</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Hermle</td><td>Z326K</td><td>para tubos cônicos</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td></td><td>Visão VS15000CFNII</td><td>para microtubos</td></tr><tr><td>Colunas de limpeza de fase reversa&nbsp; &nbsp; (Cartucho Oasis HLB 1 cc)</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>Oasis HLB 1 cc Cartucho</td></tr><tr><td>Cianoborodeuterido de sódio - NaBD3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190020</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio - NaBH3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156159</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td>NOTA: 0,2 M PB = 0,1 M tampão fosfato pH 6,8 (26,85 mL de Na2HPO3 1M) mais tampão fosfato 0,1 M pH 6,8 (23,15 mL de NaH2PO3 1M) a 250 ml de água</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo padrão</td> Sequência de aminoácidos <td>Proteimax</td><td></td><td>: Tampão de trietilamônio LTLRTKL</td></tr><tr><td>- TEAB 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético - TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Água ultra purificada</td><td>Milli-Q</td><td>Direct-Q 3UV</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga a vácuo</td><td>GeneVac</td><td>MiVac Concentrador de DNA Banho-maria</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cientec</td><td>266</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação da amostra e quantitação relativa usando metilação redutiva de aminas para estudos de peptidômica

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

A peptidomia pode ser definida como a análise qualitativa e quantitativa dos peptídeos em uma amostra biológica. Suas principais aplicações incluem identificar os biomarcadores de peptídeos de doença ou estresse ambiental, identificar neuropeptídeos, hormônios e peptídeos intracelulares bioativos, descobrir peptídeos antimicrobianos e nutracêuticos a partir de hidrólises proteicos, e pode ser usado em estudos para entender os processos proteolíticos. O recente avanço na preparação da amostra, métodos de separação, técnicas de espectrometria de massa e ferramentas computacionais relacionadas ao sequenciamento de proteínas contribuíram para o aumento do número de peptídeos identificados e peptidomes caracterizados. Estudos peptidômicos frequentemente analisam peptídeos que são gerados naturalmente nas células. Aqui, é descrito um protocolo de preparação de amostras baseado na inativação do calor, que elimina a atividade de protease, e extração com condições leves, portanto não há laços de peptídeos. Além disso, também é mostrada a quantitação relativa de peptídeos usando rotulagem estável de isótopos por metilação redutiva de aminas. Este método de rotulagem tem algumas vantagens, pois os reagentes estão disponíveis comercialmente, baratos em comparação com outros, quimicamente estáveis, e permite a análise de até cinco amostras em uma única corrida LC-MS.

Os resultados obtidos a partir das corridas realizadas no espectrômetro de massa são armazenados em arquivos de dados brutos que podem ser abertos no software de espectrômetro de massa. Nos espectros de MS, é possível observar grupos de pico representando peptídeos rotulados de acordo com o esquema de rotulagem utilizado, variando de 2-5 rótulos. Por exemplo, na Figura 2, pares de picos detectados em tempo cromatográfico são representados em um experimento onde apenas dois rótulos isotópicos...

Este artigo descreve um método de preparação amostral baseado na inativação de calor para preservar peptídeos endógenos evitando a degradação pós-morte, seguido de quantitação relativa usando rotulagem isotópica mais LC-MS.

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Aqui, descrevemos um método instrutivo baseado em uma rápida inativação de calor de protease para preservar peptídeos intracelulares naturais, evitar a degradação em células e tecidos, seguido de uma quantitação relativa de peptídeos usando rotulagem isotópica. Este método de rotulagem tem muitas vantagens. Os reagentes estão comercialmente disponíveis, baratos, quimicamente estáveis, e permitem a análise de até cinco amostras em um único soro.Comece cultivando células de neuroblastoma humano em um prato de 15 centímetros em DMEM contendo 15% FBS e estreptomicina de penicilina de 1%. Mantenha as células a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Lave as células duas vezes com PBS, depois adicione 10 mililitros de PBS, raspe as células e colete-as em um tubo de 15 mililitros.Centrifugar as células a 800 vezes G por cinco minutos e remover o supernante. Resuspend a pelota em um mililitro de água deionizada ultra purificada a 80 graus Celsius, em seguida, transfira o conteúdo do tubo para um tubo microfuçado de dois mililitros. Após a inativação de calor de zebrafish, colete todo o cérebro em um tubo de microfuge de dois mililitros e congele-o a menos 80 graus Celsius até a análise.Resuspende a amostra de tecido em um mililitro de água deionizada ultra purificada a 80 graus Celsius e sonicato com uma sonda usando 30 pulsos de um segundo. Incubar o tecido de lise celular ou homogeneizar a 80 graus Celsius por 20 minutos e depois esfrie-o no gelo por 10 a 30 minutos. Adicione 10 microlitres de uma solução de caldo de ácido clorídrico molar para cada um mililitro de volume amostral.Misture por vórtice por 20 segundos e incubar no gelo por 15 minutos. Centrifugar o lisecelular ou o tecido homogeneado a 12.000 vezes G em quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete o supernante em tubos de microcentrifuuge de proteína de baixa ligação e armazene-o a menos 80 graus Celsius.Limpe os dispositivos de ultrafiltração com água e centrífuga a 2.300 vezes G por três minutos e descarte a água do dispositivo de ultrafiltração. Pipeta o supernante em um filtro de corte pré-lavado de 10 kilodalton e gire em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius. Verifique o pH da amostra.Equilibre a coluna com um mililitro de 100% acetonitrila, depois lave-a com um mililitro de acetonitrilo de 5%com ácido trifluoroacético de 0,1%. Carregue o volume completo da amostra na coluna e lave a coluna com um mililitro de acetonitrilo de 5%com ácido trifluoroacético de 0,1%. Elute os peptídeos da coluna com 1,8 mililitros de acetonitrilo de 1%com ácido trifluoroacético de 0,15% em tubos de microcentrifuge de baixa ligação.Seque a amostra inteiramente em uma centrífuga de vácuo a 30 graus Celsius e monitore o tempo de concentração em exibição. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius. Resuspenja as amostras de peptídeos em 100 a 200 microliters de água ultra purificada e pipetas 2,5 microliters das concentrações de peptídeos padrão e amostras na placa branca de 96 poços.Adicione 25 microlitres de 0,2 tampão de fosfato molar e 12,5 microliters de fluorescamina. Homogeneize suavemente por um minuto no rotador orbital. Em seguida, adicione 110 microliters de água para parar a reação.Ajuste as configurações do espectrômetro e leia a placa. Adicione 1/10º volume de um brometo de trimetilaammonium molar a cada amostra de peptídeo com até 25 microgramas do peptídeo. Certifique-se de que o pH está entre cinco e oito, ajustando com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, se necessário.Adicione quatro microliters de formaldeído deuterado não deuterado ou formaldeído deuterado de carbono 13. Misture por cinco segundos por vórtice. Adicione quatro microliters de cianoboroidride de sódio ou cianoboroidrido de sódio desuterado à amostra de peptídeo.Em seguida, misture a amostra por cinco segundos por vórtice. Incubar a amostra de peptídeo em um capô de fumaça por duas horas em temperatura ambiente, vórtice a cada 30 minutos. Repita a adição de formaldeído deutado, deuterado ou carbono-13 deutado e cianoboroidride ou cianoboroidride de sódio deutado, vórtice após cada adição.Incubar as amostras no capô da fumaça durante a noite à temperatura ambiente. Adicione 16 microliters de bicarbonato de amônio e misture por vórtice. Coloque a amostra no gelo.Adicione oito microliters de ácido fórmico de 5% e vórtice por mais cinco segundos. Combine as amostras de peptídeos, ajuste o pH entre dois e quatro e, em seguida, desalte as amostras combinadas em colunas de limpeza de fase invertida usando acetonitrilo e ácido trifluoroacético como descrito anteriormente. Seque a amostra inteiramente em uma centrífuga de vácuo a 30 graus Celsius, depois armazene-a a menos 20 graus Celsius.Os peptídeos rotulados são observados usando espectros de massa. As setas vermelhas indicam a presença de pares de picos de peptídeos diferentes rotulados com duas formas isotópicas, L1 e L5, para comparação entre duas amostras diferentes S1 e S2, respectivamente. O espectro de massa de um peptídeo presente em três amostras diferentes, S1, S2 e S3, rotulados com etiquetas L1, L3 e L5, respectivamente, é mostrado aqui.Foi realizada uma rotulagem quádrupla. As amostras de controle S1 e S3 foram rotuladas com L1 e L3, respectivamente, e comparadas com duas amostras experimentais, S2 e S4 rotuladas com L2 e L4.No diferença significativa foi observada. A rotulagem isotópica foi usada para mostrar substratos em produtos in vitro para um determinado protease ou peptidase.Um peptídeo que não muda na presença da enzima neurolise é mostrado aqui. Peptídeos que desaparecem ou reduzem na presença da enzima são substratos, enquanto aqueles que aumentam são considerados produtos. A figura é um exemplo de identificação de uma sequência de peptídeos realizada por um mecanismo de pesquisa de banco de dados rotulado com três formas diferentes de tags.Antes de ser definido, certifique-se de que a amostra esteja completamente fria para evitar quebrar as ligações de peptídeos causadas pela acidificação dura. Além disso, a limpeza de dispositivos de ultrafiltração é essencial. espectrometria de massa é um excelente método para quantificar peptídeos entre diferentes condições experimentais e para estudos de análise, identificando substratos de peptidase.

sample-preparation-relative-quantitation-using-reductive-methylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Dois métodos para atribuir os sinais de ressonância magnética nuclear de α e ε-dimetilamina de uma lisina N-terminal 13C-metilada redutora são descritos. Um método utiliza a seletividade induzida pelo pH da reação de metilação redutiva e o outro usa aminopeptidase para remover seletivamente a lisina N-terminal.

Métodos para identificar as ressonâncias de RMN da amina N-terminal 13C-dimetil em proteínas metiladas redutivamente

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma estratégia de multiplexação de amostra aprimorada que é capaz de aumentar o número de amostras que podem ser analisadas simultaneamente com tags isobáricas disponíveis. A incorporação de uma plataforma robótica aumentou consideravelmente o rendimento experimental, a reprodutibilidade e a precisão quantitativa.

Multiplexação automatizada da amostra usando rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT)

O protocolo visa introduzir o uso de um espectrômetro de massa quadrupole triplo para monitoramento de reação múltipla (MRM) de proteínas de amostras clínicas. Fornecemos um fluxo de trabalho sistemático desde a preparação da amostra até a análise de dados para amostras clínicas com todas as precauções necessárias a serem tomadas.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

O presente protocolo descreve a preparação e a medição quantitativa de arginina e metil-argininas livres e ligadas a proteínas por espectroscopia de 1RMN-H.

Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Aprenda a preservar peptídeos endógenos por inativação térmica de proteases e quantificação relativa com marcação isotópica para estudos de peptidômica. Este método utiliza reagentes comerciais acessíveis.

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

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