Name: Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda uma técnica eficiente para isolar cardiomiócitos de camundongos sem o método Langendorff. Este protocolo reduz o tempo isquêmico com perfusão in vivo e melhora o rendimento celular para experimentos funcionais.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) e T32 HL134616 (Sturgill e Salyer).

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Ohio State University, de acordo com as diretrizes do NIH.
1. Preparação da solução
NOTA: Consulte o quadro 2 para as concentrações de tampão.
<ol><li>Pré-isolamento (até 2 semanas antes do isolamento do miócito)<ol><li>Base tampão de perfusão: Preparar 1 L de base tampão de perfusão (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, Glicose e BDM) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Ajustar para pH7,4 antes da filtração estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.</li>
		<li>Tampão de limpeza: Prepare 1 L de tampão de limpeza (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, Glicose, EDTA e BDM) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Ajuste para pH7,4 antes da filtração estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.</li>
		<li>Solução-mãe de CaCl 2 100 mM: Pesar 1,11 g de CaCl 2 e dissolver em 100 mL de solução ultrapura de 18,2 MΩ·cm H2 O. Conservar à temperatura ambienteaté ao dia do isolamento.</li>
		<li>Alíquotas de liberase: Dissolver 5 mg de enzimas digestivas em 5 mL de água estéril e livre de RNase. Preparar alíquotas de 0,8 ml e conservar a -20 °C até ao dia do isolamento.</li>
		<li>Laminar os pratos: Aplicar 100 μL de laminina de rato a 40 μg/mL de laminação de Petri de 30 mL estéreis. Deixe descansar por 30 min e remova o excesso de laminina. Coloque a laminina em uma placa de Petri com incubação UV à temperatura ambiente por 30 min. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento (podem ser utilizadas placas de Petri laminadas até 2 semanas).</li>
		<li>Meio DMEM: Em uma cabine de biossegurança, adicionar 2,5 mL de FBS, 0,5 mL de Penicilina-Estreptomicina (50 U/mL-50 μg) e 1 mL de BDM 500 mM a 46 mL de DMEM. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento (os meios podem ser utilizados até 2 semanas).</li>
		<li>Meio M199: Preparar 1 L de meio M199 (NaHCO3, HEPES, L-glutationa, M199, BDM e BSA) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Ajustar para pH 7,4 antes da filtração estéril (filtro de 0,22 μm). Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.</li>
		<li>Estoque de BDM 500 mM: Adicionar 0,5 g de BDM a 10 mL de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Conservar a 4 °C até o dia do isolamento.</li>
		<li>Criação de plataforma estabilizadora: Molde a massa em torno da base da agulha rosqueada na torneira Luer. Molde para a placa de Petri que irá conter o coração e garantir que a agulha está na altura adequada para a injeção ventricular (~5 mm acima do fundo do prato).</li>
	</ol></li>
	<li>O dia do isolamento<ol><li>Tampão de perfusão: No dia do isolamento, adicionar 9,5 mg de MgCl2 a 100 mL de tampão base de perfusão. Deixe misturar completamente antes de remover 30 mL de tampão de perfusão completo e coloque em um frasco de vidro limpo e de boca larga de 100 mL com uma tampa de tampa de rosca (tampão de digestão). NOTA: Estas adições podem ser feitas no dia do isolamento sem ajustes adicionais de pH, pois sua adição altera insignificantemente o pH.<ol><li>Retirar 12 mL de tampão de perfusão e ajustar para o lado (stop buffer). Despeje os 58 mL restantes de tampão de perfusão em outro frasco de vidro limpo, de boca larga e 100 mL com tampa de rosca. Conservar o tampão de perfusão restante a 37 °C durante todo o isolamento.</li>
		</ol></li>
		<li>Tampão de digestão: Adicionar 7,5 μL de CaCl100 mM 2 a 30 mL de tampão de perfusão para uma concentração final de 25 μM. Imediatamente antes do isolamento, adicionar 770 μL de Liberase ao tampão de digestão para uma concentração final de 26 μg/mL.</li>
		<li>Tampão de parada: Dissolver 240 mg de BSA em 12 mL de tampão de perfusão. Conservar a 37 °C durante todo o isolamento.</li>
		<li>Tampão de limpeza: Prepare uma seringa de 3 mL de tampão de limpeza e limpe a agulha de bolhas. Conservar no gelo até ao isolamento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação do coletor
<ol><li>Limpe o coletor com temperatura controlada com tampão de perfusão recém-preparado, tomando cuidado para garantir que não restem bolhas. Usando um conector Luer lock, rosqueie em uma agulha de 27 G e livre de bolhas. Uma variedade limpa é essencial para um isolamento bem-sucedido.</li>
</ol>3. Preparo dos animais
<ol><li>Injetar o rato por via intraperitoneal com 100 mg/kg de quetamina e 20 mg/kg de xilazina em peso corporal imediatamente antes do isolamento. Este procedimento foi utilizado em um camundongo C57Bl/6 macho, com 4 meses de idade.</li>
	<li>Se necessário, coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida para incentivar a sedação. Tenda os braços do rato, e tape os membros e base da cauda para uma fralda de laboratório azul. Certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado pela retirada do reflexo de pinça dos dedos. Aplique um pano estéril ao redor da área cirúrgica.</li>
</ol>4. Procedimento de isolamento de cardiomiócitos
<ol><li>Expor o esterno do camundongo e, lateralmente à linha média, cortar proximalmente através das costelas e da axila. Corte suavemente totalmente o diafragma, garantindo cortes rasos para evitar o coração. Aperte o esterno com um hemostático e dobre as costelas para trás para expor a cavidade torácica.</li>
	<li>Remover suavemente o pericárdio do coração e cortar totalmente através da veia cava inferior, imediatamente distal ao coração. Use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 27 G para injetar rapidamente 3 mL de tampão de limpeza gelado no ventrículo direito do coração durante 1 minuto.</li>
	<li>Segure suavemente o coração usando uma pinça e afaste-se do corpo, expondo o máximo possível da aorta. Usando um hemostático, pinça a aorta ascendente, tomando cuidado para não apertar os átrios, e extirpe o coração do tórax.</li>
	<li>Transfira rapidamente o coração pinçado para a tampa de uma placa de Petri de polipropileno com aproximadamente 10 mL de tampão de perfusão quente. Coloque o coração pinçado na plataforma de suporte e use uma agulha estabilizada de 27 G conectada ao coletor para injetar 10 mL de tampão de perfusão de 37 °C com temperatura controlada no ventrículo esquerdo durante 5 minutos.</li>
	<li>Transfira o coração pinçado e a plataforma de suporte para uma placa de Petri com aproximadamente 5 mL de tampão de digestão. Troque as seringas de entrada por uma seringa de 50 mL com 25 mL de tampão de digestão.</li>
	<li>Limpe o coletor de quaisquer bolhas e o tampão de perfusão restante antes da injeção. Substitua cuidadosamente a agulha na mesma posição da agulha no ápice do ventrículo esquerdo.</li>
	<li>Use uma bomba de perfusão para injetar tampão de digestão de 37 °C com temperatura controlada no ventrículo esquerdo por 15 minutos usando uma seringa de 50 mL. Controlar a temperatura da solução com uma camisa de água previamente calibrada para ejetar a solução de 37 °C na extremidade da agulha.</li>
	<li>Retire os ventrículos dos átrios e transfira para um copo de 10 mL. Adicione 3 mL de tampão de digestão ao copo e, usando uma tesoura afiada, corte os ventrículos em pedaços grandes. Cubra o copo com papel alumínio e coloque em banho-maria pré-aquecido a 37 °C por 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, tomando cuidado para evitar a retirada de pedaços de tecido. Ressuspender os pedaços de tecido em 3 mL de tampão de digestão e triturar por aproximadamente 4 min ou até que uma mistura homogênea seja alcançada.</li>
	<li>Filtrar as células através de um filtro de células de nylon de 70 μm para um tubo de polipropileno de 50 mL.</li>
	<li>Retorne o filtrado a um tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mL e centrifuja por 1 min a 100 rpm. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 3 ml de tampão stop.</li>
	<li>Adicionar 54 μL de CaCl 2 100 mM às células ressuspensas para uma concentração final de CaCl2 de 1,8 mM. Esta etapa também pode ser realizada passo a passo para aumentar o rendimento celular.</li>
	<li>Deixe as células vivas se acomodarem por gravidade por 10 minutos antes de remover o sobrenadante que contém células mortas. Ressuspender o pellet em solução de armazenamento (solução de perfusão com 200 μM de CaCl2). Essas células agora podem ser usadas para experimentos funcionais (por exemplo, imagem/contração de cálcio, patch clamp, etc.), cultura, etc. NOTA: As células também podem ser ressuspensas em soluções dependentes de laboratório ou experimento.</li>
</ol>5. Cultura celular
<ol><li>Conte as células usando um hemocitômetro ou por uma contagem de visão de campo usando uma folha de cobertura quadriculada. Como os miócitos são muito grandes, a contagem por hemocitômetro nem sempre é precisa. Isso é usado para se ter uma ideia de aproximadamente quantas células foram obtidas a partir do isolamento.</li>
	<li>Diluir as células para ~25.000 células/mL com meio DMEM. Adicionar 1 ml de solução celular a cada poço.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 durante2 h.</li>
	<li>Aspirar suavemente o meio DMEM de cada poço e adicionar 2 mL do meio M199.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 por até 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li>
<li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li>
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<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
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<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
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<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
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<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse a divulgar.

A principal vantagem de nossa técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff é que ela limita a hipóxia e o tempo de isquemia por não necessitar de canulação para um aparelho de Langendorff. Alternativamente às técnicas clássicas de Langendorff que levam vários minutos para remover, limpar e pendurar o coração, muitas vezes resultando em dano isquêmico ao miócito, nosso método inclui uma limpeza in vivo do sangue por meio de uma solução de limpeza gelada. O tampão de limpeza gelada contém ácido...

Há décadas, uma ideia essencial na literatura de biologia cardíaca é o mecanismo molecular de ação. O mecanismo de ação deve ser estabelecido para a publicação de estudos confiáveis. Uma estratégia bem estabelecida para determinar o mecanismo molecular são os estudos isolados de cardiomiócitos, que requerem cardiomiócitos de alta qualidade para a obtenção de dados confiáveis. Experimentos celulares e moleculares realizados em cardiomiócitos para determinar o mecanismo de ação são o padrão-ouro para investigar contração1, eletrofisiologia2, ciclagem de cálcio (Ca2+)3, miofilamento Ca2+ sensibilidade4, citoesqueleto5, metabolismo6, efeitos de hormônios7, moléculas sinalizadoras8, estudos de fármacos9 etc. O camundongo tornou-se a espécie de escolha para a maioria dos experimentos de biologia cardíaca devido à facilidade de manipulação genética, seu pequeno tamanho, sua vida útil relativamente curta, baixo custo, etc10. No entanto, o isolamento confiável de cardiomiócitos de camundongos de alta qualidade não é trivial com as técnicas atuais.
Os laboratórios vêm isolando cardiomiócitos há quase 70 anos11. Praticamente todas as técnicas para isolar cardiomiócitos dependem da digestão do coração através de várias enzimas (colagenase, protease, tripsina, etc.). Nos primeiros períodos (décadas de 1950-1960), foi empregado o método chunk, que envolvia a remoção do coração, o corte em pedaços bem menores e a incubação em solução com colagenase/protease/tripsina12. Na década de 1970, os laboratórios implementaram o método de "Langendorff"melhorado13, que isolava cardiomiócitos usando uma técnica de isolamento baseada na perfusão coronariana (perfusão retrógrada com enzima via aparelho de Langendorff); Esta técnica continua sendo o método dominante de isolamento de miócitos no campo hoje, ~50 anos depois14,15,16. Trabalhos recentes passaram a cularizar o coração in vivo para limitar o tempo de hipóxia e o dano isquêmico, resultando em isolamentos superiores de cardiomiócitos (melhor rendimento e maior qualidade)17. Recentemente, este evoluiu para a realização in vivo de perfusões cardíacas livres de Langendorff 18,19,20,21,22. Evoluímos a técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff baseada na técnica de Ackers-Johnson et al.18 e adaptamos vários componentes das várias técnicas de isolamento anteriores. Essas principais adaptações incluem a injeção de um tampão de limpeza gelado e a incorporação de uma plataforma de suporte para estabilizar a agulha, permitindo a diminuição da manipulação do coração. Também é detalhado nessa técnica o controle da temperatura dos tampões injetados (37 °C), que diminuiu o tempo entre a injeção in vivo e a digestão devido à menor perfusão com EDTA, como publicado anteriormente18. Diminuindo a manipulação do coração e, portanto, minimizando o tamanho do local de punção, obtém-se perfusão completa e constante das artérias coronárias. Também refinamos a técnica com um método secundário de digestão, a quantidade de EDTA no tampão de limpeza injetado e mudamos o pH. Nossa técnica descrita é mais confiável, mais eficiente e não requer treinamento/prática extensiva em comparação com o uso do aparelho de Langendorff (Tabela 1).

<table><tbody><tr><td>Seringa Bd Luer-Lok de 10 cc</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de armazenamento de mídia de vidro com tampa de polipropileno de 100 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de polipropileno de fundo redondo de 14 mL com tampa</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Monoxima de 2,3-butanodiona</td><td>Seringa Sigma</td><td>B0753</td><td>>98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Seringa BD de 50 mL sem agulha</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Space Gel Almofada de Aquecimento</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD Agulhas Hipodérmicas PrecisionGlide 27 G X 1/2"</td><td>Albumina de Soro</td><td>Bovino 305109</td><td></td>Becton Dickinson</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A3803</td><td>Fração de choque térmico, pó liofilizado, essencialmente livre de ácidos graxos, >98%</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>>99%</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Adequado para cultura de células, >99,5%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-tratado Placa de cultura de células Corning</td><td></td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Circuladores de Imersão Aquecidos</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Hemostática Mosquito</td><td>Hartman World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Câmara de Contagem Hy-Lite da Hausser</td><td>Scientific Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>Fita de Rotulagem</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Bomba de Seringa</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH Grau de Pesquisa</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>Alta concentração de termolisina</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de MagnésioInvitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminina</td><td>Corning</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>Caneta / Strep</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td> <td>> 99%</td></tr> <tr><td>Precisão Digital Banho de Água Alternativo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Adequado para célula cultura</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Filtro de células estéreis 70 &micro; m</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina para Estudantes</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>VWR Absorventes Underpads</td><td>Fisher Sci</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

um método simples e eficaz para isolar consistentemente cardiomiócitos de camundongos

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

A necessidade de métodos reprodutíveis, porém tecnicamente simples, que produzam cardiomiócitos de alta qualidade é essencial para a pesquisa em biologia cardíaca. Experimentos funcionais celulares e moleculares (por exemplo, contração, eletrofisiologia, ciclagem de cálcio, etc.) em cardiomiócitos são o padrão-ouro para estabelecer mecanismo(s) de doença. O camundongo é a espécie de escolha para experimentos funcionais e a técnica descrita é específica para o isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Métodos anteriores que requerem um aparelho de Langendorff requerem altos níveis de treinamento e precisão para a canulação aórtica, muitas vezes resultando em isquemia. O campo está mudando para métodos de isolamento livres de Langendorff que são simples, são reprodutíveis e produzem miócitos viáveis para aquisição de dados fisiológicos e cultura. Esses métodos diminuem muito o tempo de isquemia em relação à canulação aórtica e resultam em cardiomiócitos obtidos de forma confiável. Nossa adaptação ao método livre de Langendorff inclui uma perfusão inicial com solução de limpeza gelada, uso de uma plataforma estabilizadora que garante uma agulha estável durante a perfusão e etapas adicionais de digestão para garantir cardiomiócitos obtidos de forma confiável para uso em medidas funcionais e cultura. Este método é simples e rápido de executar e requer pouca habilidade técnica.

Há alguns elementos a serem examinados ao determinar o sucesso de um isolamento. Primeiro, os cardiomiócitos devem ser em forma de bastonete, sem bolhas de membrana, como as células isoladas na Figura 1. Um isolamento típico produzirá ~80% dos miócitos em forma de bastonete. Se o isolamento produzir algo menos do que 50% de células em forma de bastonete, então é considerado um isolamento malsucedido e cardiomiócitos não são usados. Por fim, os cardiomiócitos devem ser quiescentes. Miócitos e...

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Esta técnica é mais confiável e eficiente e não requer prática extensiva ou treinamento em comparação com as técnicas de aparelhos de Langendorff mais comumente utilizadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela limita o tempo de isquemia desde que a perfusão inicial ocorra in vivo. Ao realizar essa técnica, é essencial evitar bolhas no coletor e evitar movimentos excessivos do coração durante a digestão, estas podem diminuir o rendimento.Quem demonstrará essa técnica será Sarah Sturgill, aluna de pós-graduação no laboratório do Dr. Mark Ziolo. Comece limpando o coletor com temperatura controlada usando tampão de perfusão recém-preparado. Para isso, rosqueie em uma agulha calibre 27 e limpe as bolhas usando um conector luer lock.Certifique-se de que não restam bolhas. Para isolar o cardiomiócito, expor o esterno do camundongo totalmente anestesiado e lateralmente à linha média, cortar proximalmente através das costelas e da axila. Em seguida, corte o diafragma, garantindo cortes rasos para evitar o coração.Aperte o esterno com um hemostático e dobre as costelas para trás para expor a cavidade torácica. Remova o pericárdio do coração suavemente antes de cortar a veia cava inferior imediatamente distal ao coração. Injete três mililitros de tampão de limpeza gelada no ventrículo direito do coração durante um minuto usando uma agulha de calibre 27.Em seguida, segure o coração usando uma pinça. Puxe-o para longe do corpo e exponha o máximo possível da aorta. Em seguida, pinça a aorta ascendente usando um hemostático e excise o coração.Transfira rapidamente o coração pinçado para a tampa de uma placa de Petri de polipropileno contendo 10 mililitros de tampão de perfusão quente. Coloque o coração pinçado na plataforma de suporte e injete 10 mililitros de tampão de perfusão com temperatura controlada a 37 graus Celsius no ventrículo esquerdo durante cinco minutos usando uma agulha estabilizada de calibre 27 acoplada ao coletor. Em seguida, transfira o coração pinçado e a plataforma de suporte para uma placa de Petri com aproximadamente cinco mililitros de tampão de digestão.Troque seringas de entrada por uma seringa de 50 mililitros contendo 25 mililitros de tampão de digestão. Limpe o coletor de quaisquer bolhas e o tampão de perfusão restante antes da injeção. Substitua cuidadosamente a agulha na mesma posição da agulha no ápice do ventrículo esquerdo.Com a ajuda de uma bomba de perfusão, injete 37 graus Celsius tampão de digestão no ventrículo esquerdo por 15 minutos usando uma seringa de 50 mililitros. Controle a temperatura da solução com uma camisa de água calibrada para ejetar 37 graus Celsius da solução. Retire os ventrículos dos átrios antes de transferi-los para um copo de 10 mililitros.Adicione três mililitros de tampão de digestão ao copo e corte os ventrículos em pedaços grandes usando uma tesoura afiada. Cubra o copo com papel alumínio e coloque-o em banho-maria pré-aquecido a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda os pedaços de tecido em três mililitros de tampão de digestão e triture-o por aproximadamente quatro minutos ou até que se obtenha uma mistura homogênea.Uma vez feito, filtre as células em um tubo de polipropileno de 50 mililitros usando um filtro de células de nylon de 70 micrômetros. Lave o filtro de células de nylon com três mililitros de tampão de digestão. Devolva o filtrado a um tubo de polipropileno redondo de fundo de 14 mililitros e centrifugue-o.Descarte o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em três mililitros de tampão de parada. À suspensão celular, adicione 54 microlitros de estoque de cloreto de cálcio 100 milimolares para tornar a concentração final de cloreto de cálcio de 1,8 milimolar. Deixe as células vivas se acomodarem por 10 minutos e remova o sobrenadante contendo células mortas.Após ressuspender o pellet em uma solução de armazenamento, as células podem ser usadas para experimentos funcionais e culturas. Imagens de microscópio de campo claro de células isoladas mostraram que o isolamento de cardiomiócitos de camundongos produziu células quiescentes em forma de bastonete, sem bolhas de membrana ou bordas arredondadas. As células apresentaram rendimento aproximado de 80% e altas taxas de sobrevivência determinando o sucesso da técnica de isolamento.Para um isolamento bem-sucedido, é mais importante remover as bolhas do coletor e inserir a agulha no mesmo orifício do coração. Uma vez isolados, os cardiomiócitos podem ser utilizados para experimentos funcionais celulares e moleculares.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Este protocolo é usado para isolar cardiomiócitos atriais únicos do coração do rato adulto usando uma abordagem de digestão do pedaço. Esta aproximação é usada para isolar os miócitos atrial direito ou esquerdos que podem ser usados para caracterizar a electrofisiologia atrial do miócitos em estudos da remendo-braçadeira.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.

Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Este protocolo descreve modificações do método Langendorff, incluindo a profundidade da cannulação de aorta para isolamento simultâneo de miócitos atrial e ventricular de camundongos adultos.

Modificações do Método Langendorff para Isolamento Simultâneo de Miócitos Atrial e Ventricular de Camundongos Adultos

Aprenda uma técnica eficiente para isolar cardiomiócitos de camundongos sem o método Langendorff. Este protocolo reduz o tempo isquêmico com perfusão in vivo e melhora o rendimento celular para experimentos funcionais.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

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