Investigando a plasticidade sináptica de longo prazo no hipocampo interlamelar CA1 por gravação de campo eletrofisiológico
11 de agosto de 2019
Utilizamos eletrodos de gravação e estimulação em fatias de cérebro hipocampal longitudinal e eletrodos de gravação e estimulação longitudinalmente posicionados no hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciais pós-sinápticos extracelulares e demonstrar plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do CA1 interlamelar longitudinal.
A plasticidade sináptica de longo prazo, especificamente, a potencialização a longo prazo e a depressão a longo prazo têm sido amplamente investigadas ao longo da orientação transversal do hipocampo. Também foi examinado ao longo da orientação longitudinal. No entanto, quando se trata da orientação longitudinal, muito pouca atenção tem sido dada ao eixo LONGITUDINAL CA1 do hipocampo no que diz respeito à plasticidade sináptica.
Uma publicação anterior do nosso laboratório mostrou que os neurônios piramimais CA1 do hipocampo formam conexões associacionais que poderiam suportar a plasticidade sináptica. Para maior compreensão deste protocolo, recomenda-se que você se refira à publicação anterior com a referência abaixo. Injete uretano para anestesiar o rato.
Coloque o mouse totalmente anestesiado em uma almofada de aquecimento definida a 37 graus Celsius. Aplique gel ocular para umedecer os olhos. Fixar o crânio do mouse firmemente usando o grampo ocular.
O grampo ocular dá a liberdade de mobilidade para o experimentador durante os procedimentos cirúrgicos. E pode ser particularmente útil para experimentos envolvendo o córtex auditivo, também. No entanto, muito cuidado deve ser tomado para obter as coordenadas estereotaxas exatas.
Separe o tecido e os músculos subcutâneos no final do osso interparietal e occipital do camundongo com o bisturi. Borrite a matéria dura seca com cotonete. Então você perfura a cisterna magna para drenar o fluido cefalorraquidiano.
Conecte um cotonete para continuar drenando o fluido cefalorraquidiano. Corte e remova a pele do couro cabeludo e mantenha a região exposta seca. Marque os pontos correspondentes à região hipocampal usando a ajuda de uma pinça veniyar.
Faça uma incisão no crânio acima da região dorsal do hipocampo ao longo dos pontos marcados usando um bisturi ou broca de alta velocidade enquanto observa sob um microscópio. Mantenha o tecido cerebral exposto úmido aplicando soro fisiológico ou um óleo inerte. Corrija e posicione os eletrodos de estimulação e gravação firmemente no suporte estereotaxista.
Ajuste a estimulação e gravação de eletrodos acima do hipocampo dorsal CA1. Use o cérebro do rato na coordenada estereotaxic como guia na localização da coordenada para a região hipocampal longitudinal dorsal ca1. Para gravações usando eletrodos multicanais, primeiro localize suas coordenadas estereoxigráficas para a região hipocampal ca1 usando o primeiro canal.
Posicione os eletrodos restantes de tal forma que o ângulo de estimulação e registro de eletrodos esteja na faixa de 30 graus a 60 graus em relação à linha média do ponto bregma. Este ângulo corresponde à orientação longitudinal da região hipocampal ca1. Ligue o sistema de gravação.
Abra o software neural para gravação e aquisição de dados. Abaixe os eletrodos de gravação e estimulação lentamente usando o micromanipulador até que ele apenas toque a superfície do cérebro. Observe um aumento na impedância justo quando o eletrodo toca a superfície cerebral.
Isso pode ser observado no canal vermelho mostrado na tela. Abaixe lentamente os eletrodos para a profundidade aproximada correspondente às coordenadas estereotaxas escolhidas para o hipocampo CA1. Dê estimulação até que seja observado um potencial pós-sinápático repleto de evocação estável.
Realize uma curva de saída de entrada para detectar a intensidade máxima de estímulo. Use a curva de saída de entrada para definir a intensidade da linha de base e para definir a intensidade de estímulo para evocar estimulação de alta frequência ou estimulação de baixa frequência. Regisso potencial local por uma hora após estimulação de alta frequência ou estimulação de baixa frequência.
Exporte dados e analise usando software de escolha. Pobres 400 ml de solução de corte já preparada em um frasco separado e oxigenar por aproximadamente 20 minutos. Pobres 200 ml da solução de corte oxigenado.
Cubra no para filme e transfira para um freezer de 80 graus por aproximadamente 20 minutos para fazer uma lama. Pre coiule os 200 ml restantes de solução de corte em uma câmara de segurando fatias cerebrais e mantenha em bot de água de 32 graus Celsius com borbulhamento contínuo. Traga a solução de corte refrigerado e pobre aproximadamente 50 ml em um béquer.
Decapitar o rato anestesiado. Corte a pele cobrindo o crânio do rato e corte o pedaço do crânio ao longo da linha média até o osso occipital. Abra o crânio com fórceps sem cortes.
Retire suavemente o cérebro com uma espátula e coloque na solução de corte refrigerado no béquer. Separe os dois hemisférios cerebrais ao longo da linha média com uma lâmina de bisturi. Isole o hipocampo, desprendendo-o suavemente do córtex com uma espátula.
Corte a extremidade septal e temporal do hipocampo isolado. Aplique uma pequena quantidade de cola na placa de corte. Para a fatia hipocampal longitudinal CA1, conecte a região ca3 do hipocampo à placa de corte com a cola.
Para fatia transversal, que servirá de controle, conecte a extremidade ventral do hipocampo à placa de corte do vibratome. Coloque-o na câmara de corte. Ajuste os parâmetros do vibratome.
Corte o hipocampo ligado com o vibratome. Uma boa fatia cerebral hipocampal ca1 longitudinal terá uma camada de CA1, e duas camadas de giro dento. Além disso, os oriens estrato e o radiador estrato da região do CA1 estarão presentes.
Alternativamente, uma fatia cerebral hipocampal transversa terá as regiões desnúrada ca3 e CA1 em tato. Transfira as fatias cerebrais para a câmara de corte cerebral no robô de água. Incubar por 20 minutos a uma temperatura de 32 graus Celsius e levar à temperatura ambiente para recuperação.
Sobrevoe continuamente o servo ACS na câmara de gravação à velocidade de 2 ml por minuto. Transfira a fatia cerebral para a câmara de gravação, ajuste a posição da fatia cerebral com fórceps sem cortes e segure-a no lugar com um hap. Ligue o software para aquisição de dados.
Corte cerebral longitudinal. Para fatias longitudinais, posicione a estimulação e a gravação do eletrodo nos oriens estrato. Coloque o eletrodo de estimulação no lado septal ou temporal da fatia cerebral com gravação da mesma camada.
Alternativamente, posicione a estimulação e o eletrodo de gravação no radiador do estrato, coloque o eletrodo de estimulação no lado septo ou temporal da fatia cerebral. Para fatias transversais como controle, posicione o eletrodo de estimulação na região da via colateral CA3 Schaffer e o eletrodo de gravação na região do CA1. Ligue o gerador de estímulo isolador e dê estimulação.
Ajuste a profundidade do eletrodo de gravação até que seja observado um potencial pós-sináptico excitante e excitante. Realize uma curva de saída de entrada para detectar a intensidade máxima de estímulo. Use a curva de saída de entrada para definir a intensidade de estímulo para gravação de linha de base evocando estimulação de alta frequência ou estimulação de baixa frequência.
Consulte o PDF anexado para parâmetros que induzem a potencialização a termo solitário ou depressão a longo prazo. Evocou potencial pós-sináptico evocado aumentado em resposta à estimulação de alta frequência in vivo. Isso mostra que o HIPOcampal longitudinal CA1 suporta a potencialização a longo prazo.
Para as fatias cerebrais longitudinal de CA1 hipocampal, o aumento em resposta à estimulação de alta frequência foi observado tanto no lado septo quanto no temporal de oriens estrato e radiador de estrato. Isso mostra que a plasticidade sináptica induzida ao longo da região do hipocampo longitudinal CA1 não é linear ou específica de direção. Usando protocolos já estabelecidos para depressão a longo prazo, nenhuma depressão a longo prazo foi induzida tanto in vivo quanto in vitro.
Como conclusão, mostramos como investigar a plasticidade sináptica de longo prazo na região longitudinal hipocampal CA1, tanto in vivo quanto in vitro. Mais detalhes do protocolo podem ser encontrados no PDF que acompanha este vídeo para ajudá-lo a investigar a plasticidade sináptica de longo prazo ao longo da região longitudinal hipocampal CA1 em seus próprios laboratórios.
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Visão Geral
Este estudo explora a plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do eixo longitudinal da região CA1 do hipocampo, utilizando fatias cerebrais longitudinais e gravações in vivo. A investigação concentra-se em elucidar potenciais pós-sinápticos extracelulares para compreender as alterações sinápticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Plasticidade Sináptica
Contexto
- A plasticidade sináptica de longo prazo é crucial para a aprendizagem e a memória.
- Estudos anteriores focaram-se principalmente na orientação transversal do hipocampo.
- Pesquisas limitadas concentraram-se na plasticidade sináptica longitudinal do CA1.
- As conexões associativas dos neurônios piramidais do CA1 podem sustentar a plasticidade.
Objetivo do Estudo
- Investigar a plasticidade sináptica ao longo do eixo longitudinal da região CA1.
- Explorar a evocação de potenciais pós-sinápticos extracelulares in vivo.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos subjacentes às alterações sinápticas.
Métodos Utilizados
- O estudo utilizou fatias cerebrais hipocampais longitudinais e gravações in vivo.
- Os camundongos foram anestesiados com uretano para os procedimentos experimentais.
- Os eletrodos foram posicionados cuidadosamente utilizando coordenadas estereotáxicas para coletar dados.
- Protocolos de estimulação de alta e baixa frequência foram empregados para as gravações.
- Os dados foram analisados usando software neural para avaliação de formas de onda e potenciais.
Resultados Principais
- Foram registrados potenciais pós-sinápticos excitatórios evocados estáveis.
- O estudo validou os mecanismos de alterações sinápticas de longo prazo ao longo do eixo longitudinal do CA1.
- Os registros eletrofisiológicos indicam atividade sináptica significativa durante a estimulação.
- As curvas entrada-saída demonstraram a capacidade de diferentes intensidades de estímulo gerarem respostas sinápticas potencializadas.
Conclusões
- Esta pesquisa esclarece a plasticidade sináptica longitudinal pouco explorada dos neurônios CA1.
- As implicações se estendem à compreensão dos mecanismos neuronais envolvidos na aprendizagem e na memória.
- Os resultados podem orientar estudos futuros que investiguem a dinâmica e plasticidade sinápticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O entendimento da plasticidade sináptica longitudinal em redes do hipocampo CA1 fornece subsídios mecanicistas sobre a função de circuitos neurais relevantes para a validação de alvos no SNC. Este trabalho preenche uma lacuna em modelos focados em lâminas transversas ao caracterizar a conectividade associativa CA1-CA1, apoiando a redução de riscos em hipóteses envolvendo processos cognitivos dependentes do hipocampo. A abordagem eletrofisiológica bidirecional permite a avaliação do engajamento de alvos e da modulação de vias em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas envolvendo a conectividade longitudinal da via hipocampal e mecanismos de plasticidade dependentes de receptores NMDA.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de leituras eletrofisiológicas específicas por camada e por direção em redes intactas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir estados de rede com capacidade de potenciação de longa duração (LTP) de estados com deficiência em depressão de longa duração (LTD) em modelos pré-clínicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara fatias longitudinais do hipocampo validadas para medições reprodutíveis de potenciais de campo extracelulares.
- Saída Quantitativa: Gera potenciais pós-sinápticos excitatórios evocados estáveis, adequados para perfis de dose-resposta e frequência de estimulação.
- Reutilização da Plataforma: O preparo padronizado de fatias e o posicionamento padronizado dos eletrodos permitem comparabilidade entre estudos e o acompanhamento longitudinal de dados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Alinha-se aos domínios cognitivos dependentes do hipocampo em modelos de doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas.
- Continuidade Mecanística: Conecta ensaios de plasticidade na fase de descoberta à validação pré-clínica de efeitos sinápticos mediados por alvos.
- Decisões Ajustadas ao Risco: A ausência de DLP no CA1 interlaminar orienta a seleção de biomarcadores e critérios de avanço/interrompimento na triagem de moduladores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer evidências eletrofisiológicas de modulação sináptica em um subsistema hipocampal relevante para a doença.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre o envolvimento longitudinal da via CA1 e a dependência de receptores NMDA utilizando curvas entrada-saída e indução de PTL.
- Triagem: Fornece leituras padronizadas de potenciais de campo que permitem a comparação dos efeitos de compostos ao longo dos eixos septal-temporal.
- Análises: As saídas incluem magnitude da PTL, limiares de estimulação e ausência de DLT—métricas quantitativas para avaliação da modulação do alvo.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico por meio da microcircuitaria CA1 conservada e da dependência de receptores NMDA entre espécies.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para interrogatório longitudinal do hipocampo além da aplicação em um único estudo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao resolver ambiguidades mecanicistas na sinalização longitudinal do hipocampo.
- Valor Operacional: Fornece protocolos padronizados e reprodutíveis para gravação de campo in vivo e in vitro, com critérios definidos de posicionamento dos eletrodos.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção de projetos ao identificar redes com capacidade de potenciação de longa duração (LTP) e reduzir falsos negativos em triagens focadas na plasticidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis de plasticidade bidirecional em sistemas relevantes para doenças.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica, anatomia do hipocampo e interpretação de sinais eletrofisiológicos.
- Depende de sistemas de gravação estáveis, micromanipuladores e software capaz de gerar curvas entrada-saída e induzir LTP/LTD.
- Necessita padronização entre equipes quanto à orientação dos cortes, parâmetros de estimulação e duração do registro basal.
- A adaptação a outros modelos exige validação da homologia longitudinal do CA1 e da preservação da conectividade associativa.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade técnica ao ângulo do eletrodo (30–60 graus em relação à linha média) e ao drenamento de líquido cefalorraquidiano durante o preparo in vivo.
