Estabelecimento de um modelo de pancreatite aguda grave do rato usando injeção retrógrada de taurocholate de sódio no ducto biliopancreático
1 de abril de 2022
Um modelo de rato de pancreatite aguda grave é descrito aqui. O procedimento aqui apresentado é muito rápido, simples e acessível, permitindo, assim, potencialmente o estudo dos mecanismos moleculares e diferentes intervenções terapêuticas na pancreatite aguda de forma conveniente.
O objetivo geral deste vídeo é estabelecer um modelo de rato de pancreatite aguda através da injeção retrógrada de taurocholate de sódio no ducto biliopancreático. Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Soochow. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia total.
Os analgésicos não foram utilizados para não interferir no curso natural da doença, evidenciado por literaturas anteriores e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Soochow. Acelere o rato de 8 a 12 horas antes da cirurgia. Prepare filtros de solução de taurocholate de 5% de sódio através de um microfiltro 0,22.
Autoclave os instrumentos cirúrgicos e materiais, incluindo fórceps, tesouras, porta-lâminas, porta-agulhas, clipe hemostático, grampos vasculares e as cortinas estéreis. A micro-seringa foi esterilizada através da irradiação. Com o camundongo, induza uma anestesia geral com injeção intraperitoneal de solução de sódio pentobarbital de 1%a uma dosagem de 50 miligramas por quilograma.
Fixar o mouse na posição supina em uma placa plana de espuma irradiada com a fita. Remova a pele de um rato com um creme de depilação do nível do processo xiphoide até a linha de conexão da coluna ilíca superior bilateral, com os lados esquerdo e direito paralelos à linha axilar frontal. Limpe a pele duas a três vezes com 0,5% de iodophor e deixe secar por um a dois minutos cada vez.
Cubra o mouse com cortinas estéreis. Corte a camada de pele aberta e abra subcutânea. Faça uma incisão abdominal mediana de aproximadamente dois a três centímetros.
Localize o duodeno da esquerda para a direita ao longo do estômago. Puxe suavemente o duodeno para fora e para o lado esquerdo usando fórceps cirúrgicos e um cotonete encharcado de desinfetante para expor o pâncreas, o ducto biliopancreático e a papila duodenal. Use 8-0 suturas para passar pela conexão entre o duodeno e o pâncreas ao redor da papila, puxe a sutura para o lado esquerdo do corpo do rato para corrigir o duodeno.
Puxe suavemente a pele e a borda inferior do fígado de lado. Aperte o ducto hepático comum. Fure o microinjetor no duto biliopancreático distal retrógrado.
Fixar a ponta da agulha perto da papila duodenal com um grampo. Infundir 10 microlitros de 5% de sódio taurocholate no duto biliopancreático a uma taxa de 5 microlitros por minuto. Mantenha o duto biliopancreatic fechado por 5 minutos para alcançar uma pressão estável.
Remova os grampos. Retire o microinjetor, remova o outro grampo e conserte a sutura. Restaure o duodeno na posição anatômica original e verifique o sangramento.
Feche a ferida com suturas 6-0. Remova a cortina estéril. Desinfete a incisão com 0,5% de iodophor.
Recupere os animais da anestesia em uma almofada térmica de 37 graus Celsius. Administre 0,8 mililitro de 0,9% de soro fisiológico subcutâneamente para suplementação de fluidos. Em 24 horas após a operação, anestesia o mouse com sódio pentobarbital usando a mesma dose e rota de injeção.
Recolhe todo o sangue da aorta abdominal e gire a 1.500 x g durante 15 minutos para isolar o soro para testes sorológicos. Recolhe o pâncreas e os tecidos pulmonares para avaliação histologia. Mergulhe o pâncreas em solução de paraformaldeído de 4% por 24 horas.
Desidratar em uma série de concentrações de álcool e incorporar em parafina. Use um microtome para preparar 5 seções de tecido de pâncreas de espessura. Realizar coloração de H&E para a avaliação histológica do pâncreas.
Os camundongos estavam ligeiramente inativos e tiveram peso perdido em 24 horas após a operação em comparação com a pré-operação. As taxas de sobrevivência dos camundongos controle e SAP foram de 100% e 72,7%, respectivamente, em 72 horas após a operação. De acordo com os resultados da coloração da H&E das seções do pâncreas, a necrose pulpal do tecido do pâncreas pôde ser observada em camundongos SAP, enquanto não foram encontradas alterações significativas em camundongos de controle.
Além disso, níveis significativamente aumentados de atividade de amilase, lipase, pâncreas e MPO pulmonar foram encontrados em camundongos SAP em comparação com camundongos de controle. Além disso, também foram encontrados níveis significativamente elevados dos índices hepáticos e renais, incluindo ALT, AST, BUN e creatinina. Usando injeção retrógrada de taurocholate de sódio no ducto biliopancreático, pancreatite aguda grave pode ser induzida em camundongos.
Bem exposição do duto biliopancreático para garantir a punção bem sucedida. Durante a punção, certifique-se do ângulo e força adequados para evitar a perfuração do ducto biliopancreático. O modelo SAP induzido por TC é um modelo adequado para estudar os mecanismos envolvidos na pancreatite aguda grave.
É um modelo econômico usando reagentes mais baratos e este vídeo ajuda a treinar o cirurgião novato mais rapidamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um modelo de camundongo rápido e acessível para o estudo da pancreatite aguda grave por meio da injeção retrógrada de taurocolato de sódio. O modelo permite a investigação dos mecanismos moleculares e intervenções terapêuticas na pancreatite aguda.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Patofisiologia
Antecedentes
- A pancreatite aguda é uma condição grave que exige modelos eficazes para estudo.
- Os modelos existentes podem ser complexos e demorados.
- Este estudo tem como objetivo simplificar o processo de indução de pancreatite aguda em camundongos.
- Compreender os mecanismos da doença pode levar a estratégias terapêuticas melhores.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo confiável de pancreatite aguda grave em camundongos.
- Facilitar o estudo dos mecanismos da doença e das opções de tratamento.
- Fornecer um método economicamente viável utilizando reagentes facilmente disponíveis.
Métodos Utilizados
- Injeção retrógrada de taurocolato de sódio no ducto biliopancreático.
- Procedimentos com animais aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal.
- Uso de anestesia e técnicas cirúrgicas para induzir pancreatite.
- Avaliação histológica dos tecidos pancreáticos após a operação.
Resultados Principais
- A pancreatite aguda grave foi induzida com sucesso em camundongos.
- A análise histológica revelou necrose nos tecidos pancreáticos.
- Diferenças significativas nos níveis séricos de enzimas entre camundongos controle e com pancreatite aguda grave.
- O modelo demonstrou altas taxas de sobrevivência e reprodutibilidade.
Conclusões
- O modelo descrito é eficaz para o estudo da pancreatite aguda grave.
- Permite o treinamento rápido de cirurgiões iniciantes no procedimento.
- Essa abordagem pode aprimorar a pesquisa sobre intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos pré-clínicos confiáveis de pancreatite aguda grave é essencial para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta precoce de fármacos. Este modelo de injeção retrógrada de taurocolato de sódio fornece um sistema reprodutível e econômico para investigar vias fisiopatológicas e avaliar candidatos terapêuticos. Sua acessibilidade favorece a preparação para triagem em alto rendimento e o alinhamento de biomarcadores translacionais em fluxos de P&D voltados à pancreatite.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da necrose pancreática quantificável e da elevação de biomarcadores enzimáticos.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de resultados histopatológicos e sorológicos mensuráveis na indução de SAP.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos pré-clínicos ao modelar a fisiopatologia de SAP relevante ao ser humano para otimização de compostos líderes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas padronizados e relevantes para doenças, destinados à preparação de ensaios e cascatas de triagem de compostos.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade dos ensaios por meio da indução consistente de SAP mediante injeção controlada no ducto bilipancreático.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em múltiplos ciclos de avaliação de compostos devido ao baixo custo de reagentes e à simplicidade cirúrgica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece continuidade do sistema relevante à doença, desde a descoberta até a validação pré-clínica, utilizando histopatologia e biomarcadores séricos.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco por meio de elevações séricas correlacionadas de amilase, lipase, ALT, AST, BUN e creatinina.
- Alinhamento de Biomarcadores Traducionais: Permite a avaliação de terapêuticas candidatas frente a marcadores de lesão pancreática e de órgãos clinicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir testes de hipóteses, esclarecimento de vias e redução de riscos biológicos antes das etapas de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação mecanicista de vias da SAP por meio de leituras quantificáveis de necrose tecidual e marcadores inflamatórios.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e reprodutíveis por meio de injeção retrógrada padronizada e coleta pós-operatória de soro e tecidos.
- Análises: Gera variáveis dependentes quantitativas, incluindo níveis séricos de enzimas e escores histológicos para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de biomarcadores de lesão orgânica (ALT, AST, BUN, creatinina) que refletem apresentações clínicas da SAP.
- Reutilização Institucional: Funciona como uma capacidade reutilizável devido aos reagentes de baixo custo, mínima complexidade cirúrgica e alta reprodutibilidade do modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva por meio da desconsideração mecanicista da fisiopatologia da SAP e da validação do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de uma técnica simples com microseringa e parâmetros de infusão definidos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados por meio de modelagem fisiopatológica precoce.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco utilizando limiares de biomarcadores séricos e pontuação histológica como critérios para decisões de prosseguir ou não prosseguir.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia, administração de anestesia e monitoramento pós-operatório de animais.
- Depende de instrumentos cirúrgicos estéreis, microsiringa e bomba de infusão controlada para acesso ductal.
- Necessita padronização entre equipes das técnicas cirúrgicas, dos tempos pós-operatórios e dos protocolos de coleta de soro e tecidos.
- As considerações para adaptação incluem a variabilidade do modelo entre linhagens de camundongos e as respostas específicas ao taurocolato de sódio conforme o sexo.
- As limitações práticas incluem a variabilidade na taxa de sobrevivência e a necessidade de suplementação de fluidos no pós-operatório para manter a consistência do modelo.
