Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

O objetivo geral desta técnica é medir como os nematóides e seus neurônios respondem a estímulos mecânicos externos usando uma configuração de chip microfluídico com atuadores de pressão. Este método pode responder a questões-chave nos campos da mecanobiologia e biologia sensorial, como a forma como células, tecidos e animais respondem à estimulação mecânica. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz suficientemente a mobilidade do verme de maneira não invasiva para permitir imagens de alta resolução enquanto ainda tem acesso à cutícula do verme para estimulação mecânica.

Este método também pode ser usado para estudar a influência de pistas mecânicas no desenvolvimento. Pode até ser aplicado a outros sistemas, como exposição de órgãos ex vivo ou outros animais de tamanho semelhante ao C. Elegans. Configure um sistema de microscópio para excitação simultânea de GCaMP e RFP.

Uma opção é uma fonte de luz discreta que transmite apenas luz ciano e amarela. Para visualização, use uma objetiva de 10 vezes e uma objetiva de alta ampliação. Além disso, envie a imagem para um computador via câmera digital.

Em seguida, inclua um cubo de florescência e, se necessário, um filtro de excitação. Adicione um espelho dicróico ao cubo que reflita a luz ciano e amarela e transmita luz verde e vermelha. Configure um divisor de feixe com um espelho dicróico de passagem longa com um corte de 570 nanômetros.

Além disso, forneça um filtro de emissão passa-banda para luz verde a 525 nanômetros com largura de 50 nanômetros e um filtro de emissão passa-banda para luz vermelha a 632 nanômetros com largura de 60 nanômetros. Projete ambos os feixes no campo de visão da câmera. Certifique-se de que a parte verde esteja projetada na metade superior da tela e a parte vermelha na parte inferior.

Sempre use chips microfluídicos com menos de um mês. Para a configuração, primeiro carregue o reservatório de fluxo por gravidade com M9 filtrado. Posicione o reservatório cerca de 60 centímetros acima do chip e conecte-o a uma saída de chip. Em seguida, conecte a outra saída a um recipiente de resíduos com duas entradas e conecte a segunda entrada ao recipiente de resíduos a uma bomba peristáltica.

Faça todas as conexões com tubos de polietileno. Em seguida, monte interconexões, comprimentos de tubulação de 50 milímetros com conectores de tubulação de metal em ambas as extremidades. Encaixe por pressão e interconecte em cada um dos seis dedos de atuação e na entrada do sem-fim.

Agora, posicione o chip sob a ótica. Certifique-se de deixar as interconexões conectadas ao chip, pois o PDMS se desgastará rapidamente com manipulações repetidas. É vital que o atuador PDMS e a tubulação que conecta o chip ao reservatório de ar estejam devidamente vedados para garantir um bom acionamento cromático do diafragma.

Antes de carregar os animais, verifique se há perda de pressão no chip microfluídico. Meça a deflexão do diafragma realizando vários ciclos de atuação na pressão desejada. Em seguida, compare os valores quantitativos com as previsões teóricas.

Se os valores medidos não forem os esperados, verifique se há vazamentos na tubulação ou nos conectores da tubulação. O PDMS também pode ter uma elasticidade diferente devido a uma proporção alternativa de polímero base e agente de cura, ou a massa de PD pode ser antiga e excessivamente reticulada. Prepararam C.elegans sincronizados com a idade para adultos jovens ou adultos do primeiro dia, conforme descrito por Porta-de-la-Riva e companhia em sua publicação Jove de 2012.

Agora, escolha de dois a cinco jovens adultos ou hermafroditas de um dia. Escolher animais do tamanho correto é fundamental. Animais pequenos não ficarão presos no canal e animais excessivamente grandes serão difíceis de remover e podem entupir o dispositivo.

Puxe os vermes escolhidos em uma gota de M9 filtrado. Em seguida, puxe-os para um pedaço de tubo usando uma seringa de um mililitro sem puxá-los para dentro do próprio corpo da seringa. Em seguida, conecte a tubulação à interconexão na entrada do sem-fim do chip. Em seguida, ative o fluxo por gravidade abrindo a válvula para o reservatório e ligando a bomba.

Agora, observe o canal de captura com ampliação de quatro vezes e empurre suavemente os animais para dentro do dispositivo. Depois de carregar os animais na câmara de espera, use o êmbolo para fluir suavemente um deles para a frente do canal de armadilhagem, de modo que sua cabeça entre na forma cônica do canal. Se o verme não preencher toda a seção transversal do canal do nariz até perto do final do corpo, remova o verme.

Muitas vezes, os vermes muito pequenos passam direto pelo chip sem ficarem presos. Se um animal que ficou preso no canal de captura precisar ser removido, basta pressionar o êmbolo da seringa até que o verme desapareça do canal e, em seguida, carregar um novo verme. Assim que um verme estiver carregado corretamente, mude para o modo de florescência e aumente a ampliação.

Para evitar a saturação, certifique-se de ajustar a intensidade da excitação com base na intensidade da florescência. Verifique se o neurite de um neurônio de interesse está no diafragma de um dos atuadores. Esse atuador também deve ser anterior ao corpo celular do neurônio.

Caso contrário, ajuste a posição do animal puxando ou empurrando o êmbolo. Se isso não ajudar, remova o worm e carregue um novo. Além disso, se houver autofluorescência ao redor do neurônio, substitua o verme.

Uma vez que um verme esteja carregado corretamente, concentre-se no corpo celular do neurônio de interesse, determine em qual atuador o chip está em seu lado anterior e conecte esse atuador à bomba de pressão programável usando a interconexão associada. Se o experimento exigir a medição da distância entre o atuador e o neurônio, encaixe ambos no campo de visão com a parede do canal paralela à borda superior e inferior da imagem. Em seguida, defina um protocolo de pressão usando a bomba de pressão programável.

Sempre comece tirando pelo menos 50 imagens a zero kilopascals para definir uma linha de base. Em seguida, programe a forma de onda e a pressão do estímulo. Agora, execute o protocolo de imagem e pressão.

Durante a gravação, o neurônio de interesse deve ser o ponto mais brilhante em uma área de 10 pixels quadrados. Ele não pode mover mais de 10 pixels em duas imagens sequenciais e deve permanecer no campo de visão. Durante a gravação, você pode observar mudanças na intensidade da florescência quando a pressão e os atuadores mudam.

Isso indica uma estimulação bem-sucedida dos neurônios. Entre os estímulos, inclua 10 segundos a uma pressão constante de zero quilopascal. É possível gravar simultaneamente sinais de vários neurônios no campo de visão, desde que estejam separados por pelo menos 10 pixels durante toda a gravação.

Para manter as minhocas para um estudo mais aprofundado, desconecte as saídas do cavaco em direção ao fluxo de gravidade e ao recipiente de resíduos. Em seguida, pressione suavemente o êmbolo até que todo o verme seja empurrado através do canal de captura para o canal de fluxo e continue a pressionar o êmbolo até que o animal apareça em uma gota fora do chip. Agora, desconecte a seringa com o tubo e aspire o verme na gota para uma placa de ágar.

Para remover e sacrificar um verme no canal, pressione o êmbolo até que todo o sem-fim seja empurrado através do canal de captura e para o canal de fluxo. Em seguida, o verme fluirá para fora do cavaco e para o recipiente de resíduos. Após a configuração do chip microfluídico, a deflexão do diafragma foi testada.

Os valores medidos foram reprodutíveis com ligeira variação não superior a um mícron a 450 quilopascal de pressão. Depois de inserir os vermes na entrada do chip, a pele de um único animal dentro do canal de captura foi apresentada aos seis atuadores. Com esse design, o neurônio PLM geralmente não pode ser imobilizado completamente, por isso fica livre para se mover lateral e verticalmente.

Embora a ativação bem-sucedida dos neurônios PLM seja possível, o registro dos transientes de cálcio deles é difícil devido ao movimento da cauda. Uma vez no lugar, o animal foi estimulado usando um dos seis atuadores posicionados para fornecer estímulos mecânicos a cada um dos seis TRNs. Um dos três diferentes estímulos de dois segundos foi apresentado.

Uma espera em 275 quilopascais, uma rampa para 275 quilopascais ou um zumbido consistindo em um seno de 75 quilopascais de 10 hertz sobreposto ao passo de 275 quilopascal. Intervalos de 10 segundos sem pressão separaram os estímulos. Rampas de pressão e passos de pressão ativaram TRNs apenas se os estímulos atingissem pressões acima de 400 quilopascais, enquanto os estímulos de zumbido ativaram robustamente todos os TRN.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco minutos por verme. É importante lembrar que uma vedação ruim entre o chip e a lamínula, ou entre o chip e os interconectores, fará com que o dispositivo vaze e falhe. Após este procedimento, outros métodos, como imagem de voltagem ou entrega direcionada de estímulos mecânicos a diferentes neurônios, podem ser realizados para caracterizar a resposta mecânica dos nociceptores.

Além disso, como os animais podem ser recuperados após esse procedimento, a técnica pode ser usada para rastrear mutantes defeituosos em sua resposta a estímulos mecânicos. Não se esqueça de que trabalhar com gases comprimidos e produtos químicos pode ser extremamente perigoso. Tome precauções como usar roupas de proteção individual e trabalhar em capelas de exaustão quando necessário para evitar esses perigos.