Name: Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a estimular mecanicamente nematoides imobilizados em dispositivo microfluídico para imagem de alta resolução de respostas neuronais em C. elegans. Este método avança pesquisas em mecanobiologia e neurociência.

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Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez para apoiar no projeto de dispositivo e geração de animais mutantes. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios de NIH R01EB006745 (a BLP), R01NS092099 (para MBG), K99NS089942 (a MK), F31NS100318 (a ALN) e recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), sob o Horizonte 2020 pesquisa e inovação da União Europeia (do programa Convenção de subvenção n. º 715243 para MK).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo demonstra um método de distribuição precisa estimulação mecânica na pele de uma lombriga, presa em um chip microfluidic. Destina-se a facilitar a integração dos estímulos físicos para responder às perguntas biológicas e visa agilizar a pesquisa de mechanobiology em laboratórios biológicos. Esse método amplia anteriores ensaios para avaliar a função dos neurônios mechanosensory em c. elegans. Técnicas quantitativas e semi-quantitativa anteriores medido forças1,<su...

O sentido do tato fornece animais com informações cruciais sobre seu ambiente. Dependendo da força aplicada, o toque é percebido como inócuo, prazeroso ou doloroso. A deformação do tecido durante o toque é detectada pelas células especializadas Mecanorreceptor incorporadas na pele que expressam proteínas do receptor, mais comumente canais iônicos. As etapas ligando a percepção da força para ativação de canal de íon durante o toque e a dor não são totalmente compreendidas. Menos ainda se sabe sobre como o tecido da pele filtra deformação mecânica e se mecanorreceptores detectam alterações na tensão ou stress1,2,3. Esta lacuna na compreensão decorre, em parte, a falta de ferramentas adequadas para aplicar estímulos mecânicos precisos para a superfície da pele de um animal vivo enquanto observa as respostas a nível celular. Considerando que a microscopia de força atômica tem sido amplamente utilizada para aplicar e medir forças em células isoladas de4,5 e também para ativar receptores Piezo1 em vida células6, experimentos semelhantes usando animais vivos, especialmente C. elegans, têm sido notoriamente desafiadora devido a mobilidade intrínseca do assunto. Tradicionalmente, este desafio é contornado usando cola de cianoacrilato de veterinária - ou -grau cirúrgico para imobilizar animais individuais em ágar almofadas1,7,8,9. Esta abordagem tem sido produtiva, mas tem limitações relacionadas com a habilidade necessária para a imobilização por colagem e superfície do agar macio na conformidade mecânica. Uma estratégia de microfluídica é uma alternativa gratuita que evita algumas das complicações ligadas à colagem.
O nemátodo c. elegans é um organismo modelo genético cujo sistema nervoso completamente mapeado que, devido ao tamanho do animal, é uma boa opção para tecnologia microfluídica. Oferta de dispositivos baseados em microfluídica a vantagem que os animais caso contrário extremamente móveis podem ser contidos durante a execução de imagens de alta resolução e entrega de estímulos neuro-moduladora relevantes. Com a ajuda de microfluidic tecnologias, vivem animais podem ser imobilizadas sem dano10,11, permitindo o monitoramento da atividade comportamental ao longo da vida inteira de12,13 e de alta resolução imagem de atividade neuronal14,15,16,17. Além disso, muitos neurônios Mecanorreceptor necessários para o sentido de toque e a dor pode ser caracterizado em sua fisiológicas1,8, mecânica4,18,19e molecular nível20,21,22.
C. elegans sentidos suaves estímulos mecânicos para sua parede do corpo usando seis TRNs, três dos quais inervam do animal anterior (ALML/R e AVM) e três dos quais inervam posterior do animal (PLML/R e PVM). As moléculas de canal de iões necessárias para transducing uma força aplicada em um sinal de bioquímico têm sido muito estudadas em seu TRNs8. Este artigo apresenta uma plataforma microfluidic23 que permite que os investigadores a aplicar forças mecânicas precisas na pele de um imobilizado c. elegans lombriga, ao ler a deformação de seus tecidos internos pela imagem latente ótica. Além de apresentar estímulos mecânicos bem definidos, transientes de cálcio podem ser gravados em neurônios Mecanorreceptor com resolução subcellular e correlacionados com características morfológicas e anatômicas. O dispositivo consiste de um canal central de interceptação que mantém um único animal e apresenta sua pele ao lado de seis canais de acionamento pneumático (Figura 1 e Figura 2). Os seis canais estão posicionados ao longo do canal de armadilhas para entregar a estímulos mecânicos para cada um dos seis TRNs do worm. Estes canais são separados da câmara de captura por diafragmas PDMS finos, que podem ser conduzidos por uma fonte de pressão do ar externo (Figura 1). Nós calibrado a deflexão em relação a pressão e fornecer as medições neste artigo. Cada atuador pode ser abordada individualmente e usado para estimular um Mecanorreceptor de escolha. A pressão é fornecida usando uma bomba de pressão piezo-driven, mas qualquer dispositivo alternativo pode ser usado. Nós mostramos que o protocolo de pressão pode ser usado para ativar TRNs na vivo e demonstrar o funcionamento dispositivos adequados para entrega de estímulos mecânicos para adultos c. elegans, carregar animais adultos em dispositivos, realizando a imagem latente de cálcio experiências e analisando os resultados. Fabricação de dispositivo consiste de duas etapas principais: 1) fotolitos para fazer um molde de SU-8; e 2) PDMS para tornar um dispositivo de moldagem. Por uma questão de brevidade e clareza, os leitores são referidos anteriormente publicados artigos e protocolos24,25 para obter instruções sobre como produzir os moldes e dispositivos.

<table><tbody><tr><td>Máscara cromada</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', projetada em AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Máscara cromada</td><td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', projetada em AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Máscara cromada</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5'', projetada em AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>4 '' Bolacha de silício (teste B)</td> <td>Stanford Nanofabrication Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP / LITE</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador de exposição</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td> <td>de iluminaçãoOptical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 desenvolvedor</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Triclorometilsilano (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Cuidado: TCMS é tóxico e reativo à água</td></tr><tr><td>Kit de Elastômero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>PDMS pré-polímero</td></tr><tr><td>Punção de biópsia, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxigénio Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pequeno tubo metálico (0,635 mm OD, 0,4318 mm ID, 12,7 mm de comprimento); tamanho do medidor 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa Nalgene, 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>para filtrar toda a solução, pequenas partículas entupiriam o chip</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno; 0,9652 mm OD, 0,5842 mm ID</td> Seringa <td>BPE-T50</td><td></td>da <td>Solomon Scientific</td></tr><tr><td>, 1 ml</td><td>309628 BD Scientific</td><td></td><td>para captura e liberação de vermes</td></tr><tr><td>Seringa, 20 ml</td><td>309661 BD Scientific</td><td></td><td>para fluxo baseado em gravidade</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, Peristáltico bombeie</td><td>Gilson</td><td></td><td>para sugar soluções e vermes do chip Controlador de</td></tr><tr><td>fluxo microfluídico, equipado com 0&ndash; Canal de pressão de 800 kPa</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td>entrega de pressão</td></tr><tr><td>Tubulação de poliuretano transparente resistente à água, 4 mm de diâmetro interno e 6 mm de diâmetro externo</td><td>Conexão McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>do ar da casa à bomba de pressão</td></tr><tr><td>Tubulação de poliuretano transparente resistente à água, 2,6 mm de diâmetro interno e 4 mm de diâmetro externo</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>conecta a bomba de pressão a uma pequena tubulação</td></tr><tr><td>Conexão de Tubo Push-to-Connect para Ar</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>conversor métrico - imperial</td></tr><tr><td>Conector Reto para 6 mm &vezes; 1/4&Prime; Tubo OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B sistema de microscopia</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO objetivo de óleo</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT câmera digital CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X motor de luz</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Com fonte de luz ciano e verde/amarelo</td></tr><tr><td>Divisor de feixe de excitação</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>no microscópio</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Óptica de divisão de imagem</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>para dividir a emissão verde e vermelha e projetá-las em diferentes áreas no chip da câmera</td></tr><tr><td>Divisor de feixe de emissão</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>no divisor de imagem</td></tr><tr><td>Filtros de emissão GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>no divisor de imagem</td></tr><tr><td>Filtros de emissão mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>no divisor de imagem</td></tr></tbody></table>

utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Um objetivo central da mechanobiology é entender o efeito recíproco de estresse mecânico em proteínas e células. Apesar de sua importância, a influência do estresse mecânico na função celular é ainda mal compreendida. Em parte, essa lacuna de conhecimento existe porque alguns ferramentas permitem a deformação simultânea de tecidos e células, imagens da atividade celular em animais vivos e eficiente restrição da motilidade em organismos-modelo caso contrário altamente móveis, tais como o nematódeo Caenorhabditis elegans. O pequeno tamanho da c. elegans -los faz um excelente partido para dispositivos de microfluídica-com base em pesquisa, e foram apresentadas soluções para imobilização usando dispositivos microfluídicos. Embora estes dispositivos permitem imagens de alta resolução, o animal é totalmente envolto em polydimethylsiloxane (PDMS) e vidro, limitando o acesso físico para entrega de força mecânica ou eletrofisiológicas gravações. Recentemente, criamos um dispositivo que integra actuadores pneumáticos com um design de captura compatível com microscopia de fluorescência de alta resolução. O canal de atuação é separado pelo canal da interceptação de verme por uma fina membrana PDMS. Este diafragma é desviada para o lado de um verme aplicando pressão de uma fonte externa. O dispositivo pode direcionar os neurônios mechanosensitive individuais. A ativação desses neurônios é fotografada em alta resolução com indicadores de cálcio geneticamente codificado. Este artigo apresenta o método geral usando cepas de c. elegans , expressando o indicador de atividade de cálcio sensíveis (GCaMP6s) em seus neurônios receptores de toque (TRNs). O método, no entanto, não está limitado aos TRNs nem aos sensores de cálcio como uma sonda, mas pode ser expandido para outras células mecanicamente sensíveis ou sensores.

SU-8 litografia e colagem de Chip O protocolo de litografia e moldagem de PDMS sigam os procedimentos padrão. Detalhes podem ser encontrados em outros lugares23,24,25,26. O PDMS deve descascar fora a hóstia sem problemas após a cura. Se os recursos de SU-8 arrancar durante o descascamento de PDMS, ou a camada de aderência de SU-8 ou a silaniz...

Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

O objetivo geral desta técnica é medir como os nematóides e seus neurônios respondem a estímulos mecânicos externos usando uma configuração de chip microfluídico com atuadores de pressão. Este método pode responder a questões-chave nos campos da mecanobiologia e biologia sensorial, como a forma como células, tecidos e animais respondem à estimulação mecânica. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz suficientemente a mobilidade do verme de maneira não invasiva para permitir imagens de alta resolução enquanto ainda tem acesso à cutícula do verme para estimulação mecânica.Este método também pode ser usado para estudar a influência de pistas mecânicas no desenvolvimento. Pode até ser aplicado a outros sistemas, como exposição de órgãos ex vivo ou outros animais de tamanho semelhante ao C. Elegans. Configure um sistema de microscópio para excitação simultânea de GCaMP e RFP.Uma opção é uma fonte de luz discreta que transmite apenas luz ciano e amarela. Para visualização, use uma objetiva de 10 vezes e uma objetiva de alta ampliação. Além disso, envie a imagem para um computador via câmera digital.Em seguida, inclua um cubo de florescência e, se necessário, um filtro de excita

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico...

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Os pesquisadores podem desencadear o movimento sob demanda em C. elegans aplicando um campo elétrico que os vermes detectam e respondem. Este vídeo apresenta o comportamento eletrotático e mostra um protocolo de amostra que é feito em um dispositivo microfluídico.

Ensaio de eletrotaxia: um método para observar a locomoção em C. elegans

Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção...

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais empregando um dispositivo microfluidic personalizado. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos.

Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

Estabeleceu-se uma série de métodos de imobilização para permitir a irradiação de alvo de viver elegans de Caenorhabditis indivíduos usando um polidimetilsiloxano ultra-fino recentemente desenvolvidos microfluidic chip com retenção de água. Este romance imobilização no chip também é adequada para imagens observações. O tratamento detalhado e exemplos de aplicação do chip são explicados.

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

O presente protocolo descreve o projeto, fabricação e caracterização de um sistema microfluídico capaz de alinhar, imobilizar e comprimir com precisão centenas de embriões de Drosophila melanogaster com intervenção mínima do usuário. Este sistema permite imagens de alta resolução e recuperação de amostras para análise pós-estimulação e pode ser dimensionado para acomodar outros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulação de organismos multicelulares através de um sistema de compressão microfluídica de alto rendimento

Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.

Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

Este protocolo descreve imagens de lapso de tempo de C. elegans baseadas em microfluídica em todo o desenvolvimento pós-embrionário.

Imagens de C . elegans de alta resolução em todos os estágios larvais

Aprenda a estimular mecanicamente nematoides imobilizados em dispositivo microfluídico para imagem de alta resolução de respostas neuronais em C. elegans. Este método avança pesquisas em mecanobiologia e neurociência.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

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