Coleta e processamento de dados de cristalografia de nêutrons para modelagem de átomos de hidrogênio em estruturas proteicas

A cristalografia de nêutrons é uma técnica estrutural para determinar as posições dos átomos de hidrogênio em macromoléculas biológicas. As estruturas de nêutrons revelam estados de protonação e orientações de moléculas de água para elucidar mecanismos de reação e interações de ligação. Em contraste com a difração de raios-x, a difração de nêutrons tem a vantagem de ser uma técnica não destrutiva.

Proteínas com grupos fotossensíveis ou metalossensores podem ser estudadas sem sofrer danos causados pela radiação. Para realizar a cristalografia de proteínas de nêutrons, grandes cristais de proteínas frágeis são montados em capilares de quartzo para coleta de dados à temperatura ambiente. A montagem capilar de cristal não é realizada rotineiramente, tornando a demonstração dessa técnica instrutiva.

Para a colheita de cristais, abra a caixa de sanduíche selada contendo os cristais de proteína em uma placa de vidro siliconizado de grande volume de nove poços e use uma micropipeta para transferir 10 a 20 microlitros da solução do reservatório de cristalização para uma lâmina de vidro. Avalie os cristais com um microscópio. Use um microloop de tamanho apropriado para colher um cristal e coloque o cristal na gota da solução do reservatório.

Para montagem de cristal, pegue um capilar de quartzo de dois milímetros de diâmetro e 50 milímetros de comprimento, aspire o tampão do reservatório com uma pipeta e encha uma extremidade do capilar com o tampão do reservatório. Use um laço de montagem para colocar suavemente o cristal no reservatório Bata no tubo para mover o tampão do reservatório e o cristal pelo capilar e use uma pipeta longa e fina para aspirar a solução ao redor do cristal.

Use um pavio de papel fino para secar cuidadosamente o cristal e secar as paredes capilares e adicione 20 a 50 microlitros de solução tampão deuterada na extremidade do capilar. Use uma varinha de calor para derreter uma porção de cera de abelha e insira suavemente o capilar na cera de abelha derretida até que uma vedação hermética se forme. Substitua o tampão deuterado por 20 a 50 microlitros de tampão deuterado fresco nos dias dois, seis e 10 após a montagem do cristal e feche novamente o capilar com cera de abelha derretida fresca após cada troca de vapor, conforme demonstrado.

Após pelo menos duas semanas de troca de vapor, use massa para prender o capilar de quartzo no bastão de amostra do goniômetro do difratômetro de nêutrons IMAGINE que foi preso ao estágio de amostra do instrumento e abaixe a amostra e cole no feixe de nêutrons e na área do detector. Abra o programa de aquisição de dados no computador de controle da linha de luz e clique na guia de configuração para configurar a estratégia de coleta de dados e insira os parâmetros do experimento, incluindo o nome do instrumento e o nome das imagens a serem coletadas. Clique na guia coletar e insira os parâmetros de coleta de dados, incluindo o tempo de exposição e o número de quadros a serem coletados.

Na interface gráfica do usuário óptica, clique em 2,78 para o mínimo lambda e 4,5 para o máximo lambda para definir o intervalo quase para a coleta de dados. Clique em iniciar verificação para iniciar a coleta de dados. Após a coleta de dados de nêutrons, colete um conjunto de dados de raios-x correspondente no mesmo cristal na mesma temperatura.

Antes da coleta de dados criogênicos, remova a solução do reservatório da caixa de sanduíche e encha a caixa de sanduíche com solução tampão de reservatório deuterado, deixe equilibrar por uma semana e repita três vezes. Após mais três rodadas de troca de solução de reservatório, colha o cristal com um microloop e mergulhe o cristal em uma solução crioprotetora por duas horas antes de montar o cristal em um microloop conectado a um suporte de cristal criogênico. Mergulhe o cristal montado e o suporte criogênico em nitrogênio líquido.

Quando o cristal estiver congelado, monte o cristal no difratômetro de nêutrons macromolecular estágio de amostra equipado com um fluxo criogênico. Verifique se o cristal está montado e centralizado para coleta de dados, preencha as informações da proposta e clique no ícone de pasta para carregar a tabela de estratégia de coleta de dados e, em seguida, clique em enviar para iniciar a coleta de dados. Os nêutrons difratados se tornarão visíveis em tempo real à medida que forem detectados pelos detectores de tempo de voo MaNDi.

Para refinamento conjunto de dados de raios X e nêutrons, primeiro abra CCP4 e selecione converter para modificar estender o programa MTZ para combinar os sinalizadores de dados livres R dos dados de nêutrons com os dos dados de raios X. Importe o arquivo de reflexão de dados de nêutrons no formato MTZ. Selecione importar dados R livres de outro arquivo MTZ e importe o arquivo MTZ de raio-x.

Nomeie o novo arquivo MTZ correspondente e clique em executar. Em seguida, abra o pacote de software Phoenix e, em refinamento, clique em conjunto pronto. Carregue o arquivo de coordenadas da proteína, selecione para adicionar hidrogênios ao modelo se ausente e selecione HD em locais intercambiáveis, H em outro lugar no menu suspenso.

Selecione adicionar deutério às moléculas de solvente e clique em executar para começar. Para refinamento de estrutura, na guia refinamento, abra a fênix. Refine o programa para configurar o refinamento usando os dados de raios-X e nêutrons.

Na guia de configuração, insira o arquivo PDB da estrutura de raios-x resolvida. Carregue o arquivo MTZ dos dados de nêutrons. Atribua os dados do arquivo MTZ como dados de nêutrons em nêutrons livres de R.

Carregue o arquivo MTZ dos dados de raio-x e atribua-o como dados de raio-x e raio-x R livre. Em configurações de refinamento, confirme se a estratégia de refinamento padrão está selecionada e aumente o número de ciclos para cinco. Selecione todos os parâmetros, avançados e hidrogênios.

Altere o modelo de refinamento de hidrogênio para individual e desligue a força ADP e, em seguida, procure por nuclear. Selecione usar as distâncias nucleares de X-HD. Clique em executar para iniciar o refinamento.

Para a construção de modelos em Phoenix, clique em abrir em Coot. Em Coot, visualize os mapas de densidade de elétrons de raios-x e densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons. Selecione o gerenciador de exibição e exclua o mapa de densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons 2FOFC de nêutrons.

Selecione abrir MTZ e selecione abrir MTZ e abra o arquivo mtz de dados de nêutrons. Para as opções de amplitudes e fases, selecione no_fill_neutron dados nos menus suspensos para abrir os mapas de densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons não preenchidos. Realize a inspeção visual dos resíduos para determinar se o modelo se ajusta aos dados e analise os picos do mapa de densidade de diferença dos locais trocáveis de hidrogênio-deutério para determinar a orientação e ocupação corretas.

Reoriente as moléculas de água de acordo com os mapas SLD de nêutrons e as interações das ligações de hidrogênio. Ajustar o estado de protonação e a orientação dos sítios trocáveis hidrogénio-deutério do resíduo proteico de acordo com os mapas SLD de neutrões. Execute mais rodadas de construção e refinamento de modelos interativos para obter uma estrutura completa.

Os cristais de proteína hidrogenados cultivados em tampão à base de água medem aproximadamente 1.000 por 900 mícrons. Os cristais podem ser montados em capilares de quartzo para troca de vapor com tampão à base de óxido de deutério por três semanas antes da coleta de dados de difração de nêutrons. Os dados de difração de nêutrons foram coletados por vários dias com resolução de 2,30 angstrom e um conjunto de dados de difração de raios-x foi coletado no mesmo cristal.

Picos em FO menos mapas de densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons FC fornecem informações valiosas sobre a orientação de resíduos, como paragina, e picos positivos em FO menos FC densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons omitir mapas também são muito informativos na determinação dos estados de protonação de resíduos com grupos tituláveis, como histidina. Sobreposições de mapas de densidade de comprimento de espalhamento de elétrons e nêutrons para moléculas de água indicam que, embora as interações das ligações de hidrogênio possam ser inferidas a partir de dados de raios-x, os nêutrons fornecem informações claras sobre as posições dessas ligações de hidrogênio. Os mapas de omitir a densidade do comprimento de espalhamento de nêutrons podem ser usados para determinar as orientações do grupo funcional da cadeia lateral de hidrogênio-deutério.

Os mapas de densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons nos quais átomos de hidrogênio não trocáveis estão ligados ao carbono parecem incompletos quando comparados aos seus equivalentes de mapa de densidade eletrônica devido ao cancelamento de densidade. Portanto, é preferível realizar um refinamento conjunto de uma amostra com dados de raios-x e nêutrons, nos quais os dados de raios-x podem ser usados para determinar a posição da estrutura da proteína. A cristalografia de proteínas de nêutrons requer cristais grandes.

Deve-se tomar cuidado durante o manuseio e montagem do cristal para evitar danificar os cristais que podem rachar facilmente, comprometendo a qualidade dos dados. A cristalografia de proteínas de nêutrons fornece informações sobre o mecanismo de reação da proteína, potencialmente revelando resíduos cataliticamente relevantes ou moléculas de água cujo papel pode ser investigado por cinética, mutagênese ou espectroscopia.