Imagem de imunofluorescência multiplex baseada em código de barras de DNA para analisar amostras FFPE de melanoma murino geneticamente reprogramado

Apresentamos um protocolo para desenvolver e validar um painel de imunofluorescência multiplex para estudar tecidos FFPE de camundongos e demonstrar sua utilidade estudando amostras de um modelo de melanoma tratado com nanopartículas que fornecem DNA plasmático, codificando sinais imunológicos para reprogramar o microambiente tumoral. O campo estava faltando protocolos de imunofluorescência multiplex rigorosamente desenvolvidos e validados compatíveis com tecidos FFPE fixados em formalina de camundongo e embebidos em parafina.

A inclusão de parafina fixada em formalina preserva a morfologia do tecido a longo prazo, é fácil de manusear e armazenar e permite a criação de microarrays de tecido para visualização de várias amostras em uma única lâmina.

A imagem proteômica espacial melhorará a visualização e análise de um microambiente tumoral complexo, auxiliando na previsão de respostas imunes, o que pode contribuir para o desenvolvimento de melhores terapêuticas.

Usaremos este protocolo para permitir um perfil espacial aprimorado de modelos de tumores de camundongos em muitos outros tipos de tumores e diferentes órgãos imunológicos.

[Narrador] Para começar, asse as lâminas de tecido FFPE a 60 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, resfrie as lâminas em temperatura ambiente por 10 minutos antes de iniciar a desparafinização e a reidratação. Em seguida, incube as lâminas em solução de xileno duas vezes por cinco minutos cada para remover a parafina e, em seguida, reidrate o tecido movendo as lâminas através de etanol 100% duas vezes por cinco minutos cada. Coloque a lâmina sequencialmente em soluções de etanol a 90%, 70%, 50% e 30% por cinco minutos cada. Lave as lâminas duas vezes com água destilada por cinco minutos cada. Realize a recuperação do antígeno e, em seguida, use uma solução de clareamento fresca para branquear o tecido duas vezes por intervalos de 45 minutos antes de realizar a coloração com anticorpos. Em seguida, execute a coloração de anticorpos durante a noite a quatro graus Celsius usando uma câmara de plástico. Após a coloração, remova a câmara de plástico e colete o coquetel de anticorpos aplicado anteriormente. Lave as lâminas duas vezes em tampão de coloração por dois minutos cada. Incube as lâminas em um frasco de coloração contendo 40 mililitros de solução fixadora pós-coloração por 10 minutos e, em seguida, enxágue-as com PBS três vezes por dois minutos cada. Agora transfira as lâminas para metanol gelado por cinco minutos, antes de enxaguar com PBS. Aplique 200 microlitros de solução fixadora final em cada lâmina sob uma câmara de umidade. Após uma incubação de 20 minutos em temperatura ambiente, lave as lâminas em PBS novamente por três ciclos de dois minutos cada. Se estiver fazendo imagens imediatamente, limpe a lâmina ao redor do tecido usando um lenço de papel sem fiapos. Pressione a célula de fluxo por 30 segundos usando o equipamento de montagem da célula de fluxo. Se a imagem for posterior, armazene a lâmina sem aplicar a célula de fluxo no tampão de armazenamento a quatro graus Celsius. Quando estiver pronto para criar imagens, transfira as lâminas do buffer de armazenamento para o PBS por 10 minutos antes de aplicar a célula de fluxo. Em seguida, prepare buffers DMSO rodando com base nos ciclos de imagem desejados. Prepare a solução de estoque do repórter necessária para o número total de ciclos de imagem. Pipete 250 microlitros de solução de estoque repórter e cinco microlitros de cada repórter em tubos de microcentrífuga de um mililitro pretos ou âmbar rotulados. Transfira a solução para uma placa preta de 96 poços e sele-a com papel alumínio. Agora inicie o dispositivo de imagem e use o gerenciador de instrumentos para definir os parâmetros e os tempos de exposição. Coloque a placa repórter no dispositivo e, em seguida, coloque a lâmina no suporte do microscópio para iniciar a geração de imagens. Adquira imagens de tecidos manchados. Instale a versão mais recente do software de análise de patologia digital. Clique em Criar projeto e selecione uma pasta de destino para o espaço do projeto. Em seguida, clique em Adicionar imagens, seguido de Escolher arquivos. Em seguida, navegue até o arquivo TIFF QuP produzido a partir de imagens de imunofluorescência multiplex. Defina o tipo de imagem como fluorescência, mantenha as configurações padrão e clique em Importar. Se estiver usando o QuPath, clique duas vezes na nova imagem para abrir um espaço de trabalho e pressione Arquivo e Salvar periodicamente para acompanhar as alterações do projeto. Alterne a visibilidade do marcador e as configurações de visualização usando a ferramenta de brilho e contraste na barra de ferramentas. Use a ferramenta pincel ou varinha para desenhar uma anotação ao redor de toda a seção de tecido. Defina essa anotação como tecido completo, excluindo a pele sobrejacente ou regiões que não devem ser analisadas. Mantenha pressionada a tecla ALT para criar anotações negativas ou reduzir limites. Agora escolha a anotação clicando na guia Anotações e pressionando Objetos seguidos de Anotações e, em seguida, clique em Duplicar anotações selecionadas. Ligue o canal SOX 10 e, em seguida, reduza a anotação duplicada para definir a região do tumor usando a ferramenta ALT + pincel/varinha. Agora selecione a anotação completa do tecido. Em seguida, vá para Objetos seguido de Anotações e Expanda Anotações. Defina o raio de expansão para um micrômetro e clique em Executar. Renomeie esta nova anotação como Expansão total do tecido. Selecione a anotação do tumor, clique com o botão direito do mouse e selecione Inserir na hierarquia. Selecione novamente a anotação do tumor, vá para Objetos, Anotações e agora clique em Tornar inverso. Defina essa nova anotação como Estroma e repita para todas as seções de tecido. Para executar a segmentação de células, clique na guia Imagem para encontrar a largura do pixel e a altura da imagem. Baixe a extensão StarDist do GitHub. Importe o ficheiro de extensão StarDist.jar QuPath para o QuPath. Baixe também os arquivos de script groovy StarDist e o arquivo de modelo do GitHub. Para cada seção de tecido, selecione as anotações do tumor e do estroma. Na barra de configurações, clique em Automatizar seguido de Editor de scripts para abrir a interface do script. Abra o script de segmentação de célula StarDist apropriado correspondente ao tamanho do pixel da imagem. Quando solicitado, selecione StarDistcellsegmodel.pb para segmentação de célula. Após a segmentação da célula, salve a imagem e clique sequencialmente em Medir, Exportar Medidas, selecione as imagens correspondentes e defina o tipo de exportação como células e o separador como .csv. Escolha um local de arquivo de saída e clique em Preencher para incluir métricas relevantes. Para cada marcador de linhagem a ser usado em agrupamento ou fenotipagem, selecione um valor médio para exportar. Para normalização de dados proteômicos, abra o arquivo CSV exportado e trunque os cabeçalhos das colunas para manter apenas o nome do marcador. Depois de instalar a versão mais recente do R & R Studio, baixe o script .r de normalização de marcador do GitHub e execute-o para filtrar células com base no tamanho nuclear. Execute a normalização mínima/máxima para cada marcador. Depois de concluído, salve o novo arquivo CSV com os dados normalizados. A conjugação do código de barras de DNA do anticorpo foi confirmada por eletroforese de gel de proteína, mostrando bandas adicionais na região da cadeia pesada. A imagem de imunofluorescência multiplex de tumores de flanco B16-F10 tratados com nanopartículas 4-1BBL/IL-12 e anti-PD1 sistêmica mostrou expressão distinta de marcadores imunológicos em seções tumorais. O agrupamento FlowSOM identificou uma gama mais ampla de intensidades de expressão de marcadores em comparação com a fenotipagem Seurat, com uma diferença de intensidade máxima de aproximadamente 0,7 versus 0,5. A fenotipagem FlowSOM também classificou um número maior de macrófagos nos subtipos M1 e M2. A quantificação das densidades de macrófagos mostrou que o FlowSOM detectou densidades mais altas de macrófagos M1 e M2 em comparação com Seurat, enquanto Seurat classificou mais macrófagos como Outros. A análise espacial revelou que os macrófagos M2 e as células natural killer tiveram as maiores distâncias mínimas médias após o tratamento e os macrófagos M1 foram mais prevalentes em torno das células T CD8.