Name: Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de tomografia criogênica por STEM para visualização de organelas em células intactas com resolução nanométrica em amostras de espessura micrométrica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Somos extremamente gratos pelo apoio contínuo e constante do autor e mantenedor do pacote de software SerialEM, David Mastronade, e Günther Resch. P.K. foi financiado pelo Fundo Austríaco para a Ciência (FWF) através de uma bolsa Schrödinger J4449-B. Para fins de acesso aberto, os autores aplicaram uma licença pública de direitos autorais CC-BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão. M.E. e S.G.W. reconhecem o financiamento da Israel Science Foundation, grant no.1696/18, e do projeto de geminação Horizon 2020 da União Europeia, ImpaCT (grant no.857203). M.E. reconhece o financiamento do ERC no projeto CryoSTEM (subvenção n.º 101055413). M.E. é o titular da Cátedra Sam e Ayala Zacks e chefe do Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. O laboratório de M.E. se beneficiou da generosidade histórica da família Harold Perlman. Reconhecemos também o financiamento da União Europeia. Os pontos de vista e opiniões expressos são, no entanto, apenas do(s) autor(es) e não reflectem necessariamente os da União Europeia ou da Agência de Execução do Conselho Europeu de Investigação. Nem a União Europeia nem a autoridade que concede o auxílio podem ser responsabilizadas por elas.

<ol><li>Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons+of+cryo-tomography+to+larger+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterizing+cells+using+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterizing cells using tomography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+cryo+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+nucleation+of+hemozoin+at+the+digestive+vacuole+membrane+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+heme+detoxification+in+the+malaria+parasite+by+in+situ+correlative+X-ray+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Sviben, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuole-like+compartment+concentrates+a+disordered+calcium+phase+in+a+key+coccolithophorid+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga.</a> Nature Communications. 7, 11228(2016).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+visual+proteomics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards visual proteomics at high resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187(2021).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+ferritin+crystallization+revealed+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography.</a> Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).</li>
<li>Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy%3A+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Imaging+and+Electron+Physics%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy: biological applications.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).</li>
<li>Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSTEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CryoSTEM tomography in biology.</a> Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition-A+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+theoretical+basis+and+limitations+of+cryo-STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens.</a> Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+remote+data+collection+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63923(2022).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+electron+tomography+of+cells+using+SerialEM+and+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTOMO%3A+An+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> Journal of Structural Biology. (6), 100068(2022).</li>
<li>Seifer, S., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClusterAlign%3A+A+fiducial+tracking+and+tilt+series+alignment+tool+for+thick+sample+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Imaging%22%5BJournal%5D)">ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography.</a> Biological Imaging. 2, 7(2022).</li>
<li>Waugh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+deconvolution+processing+for+STEM+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).</li>
<li>Kirchenbuechler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-STEM+tomography+of+intact+vitrified+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts.</a> AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lazić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+structures+from+iDPC-STEM+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution.</a> Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).</li>
<li>Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+STEM+with+simultaneous+phase+and+depth+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).</li>
<li>Ophus, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+scanning+transmission+electron+microscopy+%284D-STEM%29%3A+from+scanning+nanodiffraction+to+ptychography+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+phase+retrieval+of+biological+specimens+using+cryo-electron+ptychography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography.</a> Nature Communications. 11 (1), 2773(2020).</li>
<li>Nellist, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">The principles of STEM imaging.</a> Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).</li>
<li>Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+isolated+protein-bound+metal+ions+by+single-particle+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O protocolo deve auxiliar microscopistas de ciências da vida interessados em obter uma visão 3D de organelas intracelulares em regiões da célula que não são acessíveis à tomografia convencional de TEM. O mesmo protocolo também pode ser usado para tomografia STEM de cortes plásticos, com restrições relaxadas na exposição. O protocolo deve ser considerado como um ponto de partida e não como um conjunto de regras rígidas. De fato, o poder do STEM é sua flexibilidade; não há uma maneira certa de operá-lo.
Ressaltamos que STEM, por si só, refere-se apenas à sonda digitalizada e não define a formação da imagem. O contraste depende principalmente da configuração dos detectores. Os métodos mais simples empregam detectores com simetria axial, seja um disco centrado no eixo óptico ou um anel ao seu redor. Em geral, quando a iluminação incide diretamente sobre o detector, registramos uma imagem BF onde o espécime (espalhamento de elétrons) aparece escuro; por outro lado, quando o detector coleta apenas elétrons espalhados, registramos uma imagem DF onde o espécime denso parece brilhante. Quando o hardware adequado está disponível, o SerialEM pode adquirir e gravar esses dois sinais simultaneamente. Configurações ainda mais sofisticadas estão disponíveis, variando de detectores com vários segmentos a câmeras totalmente pixeladas. A imagem com contraste de fase pode ser obtida, por exemplo, avaliando-se a diferença entre os elementos detectores fora do eixo32,33. A coleta de todo o padrão de espalhamento 2D (difração) por pixel define o método conhecido como 4D STEM34, que permite a reconstrução de múltiplos contrastes de imagem a partir dos mesmos dados originais. O STEM quadridimensional permite a pticografia eletrônica, que fornece outro meio para obter contraste de fase35.
Nós nos concentramos na modalidade STEM particular que consideramos ser mais útil para o estudo de organelas e células intactas ou cortes celulares de mícron grosso. Isso implica especificamente o uso de imagens BF com um pequeno ângulo de semiconvergência na iluminação e um ângulo de coleta relativamente grande no detector. A pequena convergência fornece uma grande profundidade de campo para que toda a amostra permaneça em foco durante toda a série de inclinação19. Na prática, com um bom estágio do microscópio, também pode eliminar a necessidade de ajuste do foco durante a aquisição. O preço é um compromisso na resolução, conforme descrito na seção 3 do protocolo. Sugerimos imagens 4k com uma sonda de ~2 nm, que com espaçamento de pixel de 1 nm atinge um campo de visão de 4 μm. No entanto, o leitor é fortemente encorajado a experimentar. A segunda consideração está na lateral do detector. Quando o disco de iluminação preenche o detector BF no eixo, o contraste de fase é suprimido e o contraste de espalhamento (amplitude) domina; Essa condição tem sido chamada de contraste incoerente de campo brilhante36. A questão é por qual fração preencher, e a resposta depende da amostra. Uma amostra muito fina mostrará melhor contraste com o detector completamente preenchido (ou seja, o ângulo de coleta correspondente ao da iluminação), mas uma amostra mais espessa espalhará toda a intensidade, deixando um sinal ruidoso com contraste fraco. Uma regra prática útil é que quanto mais espessa a amostra, maior deve ser o ângulo de corte externo do detector de BF21. O tamanho e a posição do detector são, naturalmente, fixos, de modo que o tamanho do disco de difração é ajustado usando o comprimento da câmera, conforme descrito na seção 1. Se as configurações do amplificador do detector forem tais que o sinal preencha a faixa dinâmica, mas não satura sob iluminação direta (1.12.3), então o comprimento da câmera pode ser aumentado até que uma intensidade de sinal e contraste razoáveis sejam alcançados. Mais uma vez, o leitor é encorajado a experimentar. A arte, por assim dizer, está nos ângulos.
Outro parâmetro, não discutido no protocolo, é a tensão de aceleração do microscópio. A interação dos elétrons iluminantes com o espécime será mais forte em uma tensão mais baixa. Com tudo o mais igual, podemos esperar maior contraste em tensão mais baixa. Por outro lado, é o início de múltiplos espalhamentos dentro do corpo de prova que limita a espessura do corpo de prova utilizável, de modo que uma tensão mais alta permite o uso de amostras mais espessas. Esses efeitos são bastante sutis, no entanto. Nossas experiências até o momento com acelerações de 200 kV e 300 kV são semelhantes.
Considerando o que se pode esperar de STEM em termos de resolução, isso novamente depende da amostra e da configuração do detector. Usando uma abordagem de análise de partícula única, íons metálicos sobre ferritina poderiam ser localizados por STEM de campo escuro anular com uma precisão de alguns angstrom37. Mais recentemente, a resolução subnanométrica foi obtida para amostras de vírus e proteínas usando imagens obtidas por contraste de fase diferencial integrado (iDPC) STEM32 , bem como pticografia35. Para objetos únicos em espécimes celulares espessos, e com os métodos descritos aqui, essa alta resolução não é realista. A resolução ótima é o diâmetro da sonda, que se relaciona com o ângulo de semiconvergência como descrito. Outros fatores degradarão a resolução, particularmente uma amostragem de pixel grosso para alcançar um grande campo de visão, desalinhamentos na série de inclinação e espalhamento do feixe de sonda na transmissão. As imagens se comparam bem com a tomografia de corte plástico. Com a configuração descrita aqui, por exemplo, deve ser fácil ver o núcleo oco dos microtúbulos, mas não os protofilamentos individuais.
Para resumir, os métodos STEM e o hardware estão em fase de desenvolvimento. Podemos esperar que as inovações em imagem também impactem a tomografia, levando STEM a domínios que não foram acessíveis por outras técnicas. Esperamos que uma convergência com imagens de fluorescência criogênica correlativa baseada em métodos modernos de super-resolução óptica seja especialmente frutífera. A escala de organelas, 100-1.000 nm, é um alvo ideal para esses métodos emergentes.

A visualização tridimensional (3D) de organelas é uma tarefa primordial na biologia celular moderna. Dadas as escalas envolvidas, variando de dezenas de nanômetros para vesículas secretoras a muitos mícrons para o núcleo celular, é desafiador encontrar uma única técnica de microscopia para atender a todas as aplicações. Enquanto a microscopia de fluorescência moderna pode abranger grande parte do intervalo em termos de resolução, apenas as moléculas marcadas aparecem. O teatro celular continua sendo o reino da microscopia eletrônica. Os métodos convencionais de fixação química, incorporação plástica e coloração com metais pesados são fortemente invasivos, de modo que os resultados podem depender dos detalhes da preparação da amostra. O crio-EM, por outro lado, é limitado pela necessidade de vitrificação do meio aquoso; cristais de gelo que formam difratam a iluminação eletrônica, causando artefatos de contraste de maior contraste do que o material orgânico de interesse.
Na última década, proliferaram técnicas de imagem em ME desenvolvidas ou adaptadas para estudoscelulares1. O congelamento a alta pressão combinado com fresagem iterativa por feixe de íons focalizados (FIB) e imagens seriadas de superfície usando o microscópio eletrônico de varredura (i.e., FIB-SEM) é atualmente o método de escolha para grandes espécimes2. A tomografia criogênica de raios X moles (crio-SXT) é adequada para amostras de vários mícrons de tamanho, limitado pelo comprimento característico de absorção dos raios X moles em água 3,4,5. Essa escala inclui muitos tipos celulares intactos, e a natureza quantitativa do contraste de absorção de raios X adiciona um aspecto de medição de concentração6 ou espectroscopia7. Quando combinada com a média do subtomograma, a tomografia eletrônica de criotransmissão (crio-TE), baseada em microscopia eletrônica de transmissão por contraste de fase (MET), oferece a mais alta resolução para macromoléculas ou complexos 8,9,10. No entanto, é raro que organelas intactas sejam tão regulares que possam ser médias inteiras. Além disso, o modo convencional de MET de campo largo é limitado para a espessura do espécime a algumas centenas de nanômetros pela combinação de espalhamento inelástico (envolvendo perda de energia) no espécime e aberração cromática na objetiva magnética11,12. A grande dispersão de energia dita o uso de um filtro de energia para remover a névoa fora de foco resultante, mas o espécime sensível ainda sofre danos de radiação, enquanto o sinal de imagem se torna exponencialmente mais fraco com o aumento da espessura.
O modo alternativo de imagem, scanning transmission EM (STEM), contorna a necessidade de filtragem de energia e retém os elétrons espalhados inelasticamente para a formação da imagem, embora atualmente em uma resolução menor do que para a tomografia por TEM (Figura 1). Na verdade, nenhuma imagem real é formada. Em vez disso, como em um EM de varredura, as medições são feitas ponto a ponto, e a imagem é montada pelo computador. A ampliação é determinada apenas pelo tamanho das etapas de varredura sem alterar as correntes da lente. Quando bem configurada, a faixa útil de espessura da amostra para tomografia crio-STEM (CSTET) pode chegar a 1,5 ou até 2 μm, embora a zona de conforto, onde a intensidade útil do sinal permanece uma fração significativa da iluminação, esteja em torno de 600-900 nm11,13. Isso é suficiente para ver uma grande fração do citoplasma e, ocasionalmente, uma borda do núcleo celular. Na prática, descobrimos que a vitrificação pelo método padrão de imersão em fluido criogênico impõe uma restrição mais severa na espessura do que a imagem STEM. O objetivo deste artigo em vídeo é facilitar a incorporação do CSTET no tórax de ferramentas para imagens de células e organelas em laboratórios de pesquisa e instalações de microscopia.
O primeiro desafio é que as operações de microscópio no CSTET ainda não estão padronizadas para aplicações em ciências da vida da mesma forma que têm sido para a tomografia por crio-TEM. O hardware STEM raramente (ou nunca) foi direcionado para o mercado de crio-EM. No entanto, isso está mudando com a mais nova geração de microscópios, e muitas ferramentas existentes podem ser adaptadas. A técnica STEM tem decolado e assumido largamente as ciências dos materiais, onde também há um crescente interesse em métodos criogênicos e de baixa dose14,15. A literatura de ciência dos materiais é abundante com siglas BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., que aumentam a confusão. Oferecemos aqui um ponto de partida recomendado que, em nossa experiência coletiva no Instituto Weizmann de Ciências, fornece o protocolo mais geral para resultados úteis baseados em imagens STEM de campo brilhante (BF)16. De forma alguma esgota ou mesmo explora o leque de possibilidades, mas servirá de base para novos aprimoramentos. Embora enfatizemos a crio-STEM, a maior parte do protocolo é igualmente relevante para a tomografia STEM à temperatura ambiente de cortes embebidos em plástico.
A essência do STEM é escanear o espécime com uma sonda eletrônica focalizada (Figura 1), o cone de iluminação, e registrar sinais do plano de difração (espalhamento) em transmissão, pixel a pixel, para produzir imagens 2D17,18. Espécimes amorfos, incluindo a maioria dos materiais celulares, produzirão um padrão de espalhamento difuso na transmissão. A configuração STEM prática mais simples é colocar um detector circular para registrar o disco central (ou seja, a iluminação da sonda que seria transmitida sem uma amostra). O espécime espalha elétrons para longe deste cone de iluminação na medida em que o sinal diminui. Isso produz uma imagem BF - o espécime aparece escuro em um fundo brilhante. Um detector anular também pode (ou em vez disso) ser usado para detectar o espalhamento do espécime fora do cone de iluminação. Com o espécime retirado, não há sinal. Quando um espécime está no lugar, os objetos aparecem brilhantes em um fundo escuro na imagem de campo escuro (DF). A nomenclatura para STEM (BF, campo escuro anular [ADF], campo escuro anular de alto ângulo [HAADF], etc.) refere-se principalmente às faixas de ângulos de coleta para os detectores.
O ângulo de convergência da iluminação representa uma adaptação essencial do STEM à tomografia celular. Quando a prioridade máxima é alta resolução, o ângulo de convergência deve ser o maior possível. (Isso é semelhante à microscopia confocal de varredura a laser; a resolução é determinada pelo diâmetro da sonda, que escala como o comprimento de onda dividido pela abertura numérica. Note que nos referimos ao ângulo de meio-ângulo ou semi-convergência para EM.) Quando a prioridade é a profundidade de campo, por outro lado, um comprometimento na resolução oferece uma grande vantagem, pois o feixe focalizado permanece aproximadamente paralelo por uma distância igual ao dobro do comprimento de onda dividido pelo semiângulo quadrado. O ideal é que todo o volume celular permaneça emfoco19. Por exemplo, a 300 keV, o comprimento de onda do elétron deBroglie é de 0,002 nm, então uma convergência de 1 mrad produz uma resolução de 2 nm e uma profundidade de campo de 4 mícrons. Nessas condições, a tomografia pode ser realizada mesmo sem foco durante o processo de coleta de dados, mas apenas uma vez no início da aquisição. Um STEM convencional capaz de tomografia pode atingir um ângulo de semiconvergência de 7 ou 8 mrad; Portanto, em princípio, poderíamos chegar a uma resolução da ordem de 0,25 nm, mas então com uma profundidade focal de apenas 62 nm. Isso é claramente muito fino para imagens celulares. Microscópios mais avançados com três lentes condensadoras oferecem ajuste contínuo do ângulo de semiconvergência em uma faixa considerável. Com a configuração mais tradicional de dois condensadores, a convergência é fixada discretamente pela abertura do condensador (C2).
Para amostras robustas embutidas em plástico, pode-se gravar uma série focal em cada inclinação e combiná-las para alta resolução20, mas para amostras criogênicas, o orçamento de radiação é muito restrito. Finalmente, na ponderação das vantagens da imagem de FS ou FD, para espécimes espessos, deve-se considerar os efeitos do espalhamento elástico múltiplo no espécime. O sinal do FS é menos corrompido por espalhamento múltiplo e apresenta maior resolução para espécimes espessos16,21.
Uma regra prática útil tem sido definir ângulos de coleta várias vezes maiores do que a convergência. Quanto mais espesso o espécime, maior deve ser o disco de coleta. Um disco muito pequeno fornecerá uma baixa intensidade de sinal; Um disco muito grande resultará em contraste de imagem ruim, pois apenas a dispersão de ângulo mais alto contribuirá. Os ângulos de coleta devem ser otimizados para uma determinada amostra. Os ângulos do detector em função do comprimento da câmera (difração) devem ser calibrados independentemente. Eles podem ser exibidos convenientemente pelo software do microscópio. Na prática, um fator de dois a cinco na razão entre os semiângulos de coleta e iluminação, θ e α, respectivamente (Figura 1), é um ponto de partida recomendado para o CSTET de espécimes celulares.
O protocolo a seguir descreve a operação da tomografia STEM utilizando o popular software SerialEM para controle microscópico22,23. SerialEM não está vinculado a um fabricante específico, e é amplamente utilizado em tomografia de TEM. A maioria das operações de montagem para tomografia pode ser realizada diretamente do TEM. A estratégia do SerialEM é modelar o sistema de digitalização como uma câmera. Isso permite o cruzamento simples de TEM para STEM. Deve-se ter em mente, no entanto, que parâmetros como ampliação e binning são totalmente artificiais. Os parâmetros importantes são o campo de visão em mícrons, o número de pixels no campo de visão e o tempo de exposição. O espaçamento entre pixels, ou amostragem, é o campo linear dividido pelo número de pixels, enquanto o tempo de permanência é o número de pixels dividido pelo tempo de exposição.
A configuração mínima para STEM e CSTET envolve três recursos no microscópio: um gerador de varredura, um detector STEM e um software de controle de tomografia. O protocolo refere-se à nomenclatura da FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), mas os conceitos são genéricos. O software proprietário do TFS foi descrito no JoVE para TEM24, e a operação STEM é muito semelhante.
Assumimos que o microscópio foi alinhado com antecedência pela equipe de serviço ou equipe experiente e que um alinhamento de coluna pode ser chamado carregando um arquivo. Pequenos ajustes são chamados de alinhamentos diretos e podem ser armazenados nos chamados registradores FEG (microscópios TFS). Os alinhamentos diretos incluem centro de rotação, pontos de pivô, alinhamento de difração e compensação para o astigmatismo do condensador. Os ajustes devem ser realizados de forma iterativa. Observe que os microscópios TFS implementam modos distintos de nanossonda (nP) e microssonda (μP); para uma dada abertura do condensador, estes fornecem um campo de visão relativamente estreito ou largo com iluminação paralela em MET e um feixe de elétrons mais ou menos convergente (fortemente focado) em STEM, respectivamente. Outros fabricantes utilizam esquemas diferentes para cobrir a gama de ângulos de convergência.
Antes de iniciar, deve-se escolher o campo de visão, L, e a amostragem (largura do pixel), l, dependendo da amostra em estudo. Por exemplo, para l = 1 nm/pixel, uma imagem de 4.000 x 4.000 pixels que cobrirá um campo de visão de 4 μm2 deve ser escolhida. A resolução será, na melhor das hipóteses, o dobro da amostragem espacial, então 2 nm, e o diâmetro da sonda, d, deve corresponder a isso. A calibração do ângulo da sonda está além do escopo deste protocolo, então assumimos que uma tabela ou uma leitura de tela está disponível. O diâmetro da sonda é aproximadamente o comprimento de onda do elétron dividido pelo ângulo de semiconvergência (em radianos): d = λ/θ. O comprimento de onda, λ, é de 0,002 nm para 300 keV e 0,0025 nm para elétrons de 200 keV, então θ de 1 mrad fornecerá um diâmetro de ponto de 2 ou 2,5 nm, respectivamente.
O protocolo apresenta-se numa progressão de complexidade crescente. A primeira tarefa é produzir uma imagem STEM, que depende do software do fabricante do microscópio, e depois uma série de inclinação, para a qual usamos o SerialEM. Muitos leitores, sem dúvida, estarão familiarizados com o SerialEM, então as tarefas mais complicadas virão naturalmente. Não há necessidade de seguir os procedimentos rigorosamente. Desenvolvimentos relacionados à automação podem ser implementados diretamente para STEM e TEM. Usuários experientes provavelmente inverterão o protocolo, começando com o registro correlativo de mapas de fluorescência e continuando a configurar a tomografia em lote. Mais detalhes podem ser encontrados na extensa documentação e bibliotecas de tutoriais do próprio SerialEM, incluindo um artigo recente do JoVE sobre os últimos desenvolvimentos em automação25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; SerialEM</td><td>University of Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM é uma plataforma de software livre para controle de microscópio e aquisição de dados.</td></tr><tr>Microscópio <td></td><td></td><td>eletrônico de transmissão com capacidade STEM</td><td>O protocolo foi escrito com base na experiência com vários microscópios da Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica e Tecnai T20-F. Em princípio, deve ser aplicável também a outros fabricantes.</td></tr></tbody></table>

visualização de organelas in situ por tomografia crio-stem

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) baseia-se na obtenção de imagens de espécimes biológicos ou orgânicos embutidos em seu meio aquoso nativo; A água é solidificada em um vidro (ou seja, vitrificado) sem cristalização. O método crio-EM é amplamente utilizado para determinar a estrutura de macromoléculas biológicas recentemente em uma resolução quase atômica. A abordagem foi estendida para o estudo de organelas e células usando tomografia, mas o modo convencional de imagem EM de transmissão de campo largo sofre uma severa limitação na espessura da peça. Isso levou a uma prática de moagem de lamelas finas usando um feixe de íons focalizado; A alta resolução é obtida pela média do subtomograma das reconstruções, mas relações tridimensionais fora da camada restante são perdidas. A limitação de espessura pode ser contornada por imagens de sonda digitalizadas, semelhante ao EM de varredura ou ao microscópio confocal de varredura a laser. Enquanto a microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) em ciência dos materiais fornece resolução atômica em imagens únicas, a sensibilidade de espécimes biológicos criogênicos à irradiação eletrônica requer considerações especiais. Este protocolo apresenta um setup para criotomografia utilizando STEM. A configuração tópica básica do microscópio é descrita para sistemas de dois e três condensadores, enquanto a automação é fornecida pelo software não comercial SerialEM. Aprimoramentos para aquisição de lotes e alinhamento correlativo a mapas de fluorescência previamente adquiridos também são descritos. Como exemplo, mostramos a reconstrução de uma mitocôndria, apontando a membrana interna e externa e grânulos de fosfato de cálcio, bem como microtúbulos circundantes, filamentos de actina e ribossomos. A tomografia crio-STEM se destaca por revelar o teatro de organelas no citoplasma e, em alguns casos, até mesmo na periferia nuclear de células aderentes em cultura.

Uma montagem de grade completa preparada em STEM mostra as áreas com células de interesse (Figura 4). Observe que a imagem está em campo escuro, então buracos vazios parecem escuros. As células aparecem parcialmente brilhantes, onde os elétrons são espalhados em direção ao detector HAADF. Nas partes mais grossas, normalmente os centros ou perto das barras de grade, o contraste fica escuro novamente. Isso se deve ao espalhamento múltiplo, pelo qual os elétrons atingem ângulos não captados pelo detector. Na prática, essas áreas serão muito espessas para a tomografia.
A próxima etapa envolve mapas de magnificação intermediária (Figura 10). Estes são muitas vezes chamados de mapas de montagem média, ou mapas quadrados, referindo-se aos quadrados da grade em vez da forma. Mesmo no modo STEM de microssonda mais baixo, eles também serão adquiridos como imagens de montagem. Clicar no item na janela Navegador carrega a imagem do mapa na janela principal. Pontos específicos para aquisição de tomograma são escolhidos dentro desta área. Use o modo de visualização para localizar a área na ampliação da gravação. Lembre-se de que pode haver uma mudança lateral entre Visualizar e Gravar, dependendo das velocidades de varredura. Uma única série de inclinação pode ser gravada aqui. As mitocôndrias, por exemplo, muitas vezes podem ser identificadas na imagem Preview and Record (Figura 12).
Para a tomografia em lote, o palco percorrerá a grade e poderá não retornar exatamente ao mesmo local. Os mapas âncora são usados para garantir que as áreas desejadas do Registro sejam reidentificadas de forma confiável, combinando a imagem de visualização com uma exibição de ampliação inferior, mesmo que o movimento do palco tenha mudado. O PyEM23,24 oferece uma alternativa mais rápida que certamente é recomendada, mas ainda não faz parte da instalação padrão.
Na abordagem CLEM, um mapa de fluorescência pode ser usado para identificar as áreas de interesse para a tomografia. A fluorescência é adquirida externamente e deve ser registrada na montagem completa da grade. É útil ter as barras de grade e os furos visíveis, para que um composto de fluorescência mesclada + campo brilhante possa ser preparado antes da importação, por exemplo, no software GIMP (https://www.gimp.org) ou ImageJ31 (tome cuidado para que o ImageJ inverta o eixo vertical). Quando a faixa dinâmica da fluorescência é grande, pode ser difícil criar essa fusão sem saturação. Nesse caso, os dois mapas podem ser importados separadamente e, em seguida, registrados juntos, conforme descrito (Figura 13). Dessa forma, um ponto no mapa de fluorescência na janela Navegador, seguido de "Go To XY", traz o palco para a posição correspondente na grade montada no MET. Tome cuidado para que pequenas inconsistências na criação da montagem (ou do mapa de fluorescência, se também for uma montagem) levem a pequenos deslocamentos; portanto, para uma precisão ótima, a fluorescência deve ser re-registrada especificamente para o mapa quadrado. Muitas vezes é suficiente fazer esse registro a olho, com base em furos na película de suporte ou características compartilhadas com a imagem de luz de campo brilhante.
A reconstrução da série de inclinação resulta em um volume 3D (Figura 14). Este exemplo tem um tamanho de pixel de 2,042 nm, o que resulta em um campo de visão de ~4 μm. Destacam-se os depósitos de fosfato de cálcio (pontas de seta alaranjadas), devido ao maior número atômico em relação ao entorno. Os microtúbulos (pontas de setas vermelhas) podem ser traçados em todo o campo de visão. Além disso, as membranas mitocondriais interna e externa (pontas de setas verdes) podem ser claramente vistas. A actina pode ser observada como feixes ou como filamentos individuais. Para obter uma resolução mais isotrópica, a reconstrução pode ser processada por deconvolução.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Figura 1: Comparação entre ETM e STEM. No MET, o campo de visão é iluminado por um feixe quase paralelo, e a lente objetiva forma uma imagem ampliada na câmera. Para o crio-TEM, a abertura objetiva é aberta para passar as ondas de elétrons espalhadas (linha vermelha tracejada), que, com o desfoco, produzem contraste de fase por interferência com as ondas não espalhadas (verdes). STEM, por outro lado, rasticula um feixe focado através do espécime e coleta os elétrons espalhados de maneira pixel a pixel. Múltiplos detectores podem coletar elétrons espalhados em diferentes ângulos. Este número foi modificado de30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo de distorção da imagem no lado esquerdo devido à alta taxa de varredura. Observe a distorção marcada por pontas de seta amarelas, bem como, os orifícios ovais distorcidos no Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Figura 3: Diálogo de configuração de montagem para toda a montagem de grade. Escolha a ampliação e o número de peças em X e Y para que a área total atinja cerca de 2.000 μm para obter um mapa para a maior parte da grade. Escolha também Mover estágio em vez de deslocar imagem e Usar mapeamento de montagem, não Parâmetros de registro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Figura 4: GridMap de baixa ampliação total gravado no modo STEM. As áreas quebradas aparecem completamente pretas na imagem de campo escuro. Áreas cinza escuras são provavelmente muito espessas e mal vitrificadas. Boas áreas candidatas para tomografia são brancas ou cinza claro neste exame. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Figura 5: Mudança para o processo de marcação. Um objeto reconhecível é marcado no mapa de baixa resolução por Adicionar pontos (38 nesta imagem). Observe a mudança entre o mapa de baixa resolução (círculo verde) e o mapa de média resolução (círculo laranja). Em seguida, o objeto é marcado pelo marcador (cruz verde, círculo vermelho) e a caixa de diálogo Deslocar para marcador é iniciada. A opção escolhida move todos os mapas em 245x pela mesma quantidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Figura 6: Diálogo de configuração da série Tilt para uma série de inclinação STEM. O esquema dose-simétrico é usado de -60° a +60° em passos de 2°. O foco automático é ignorado devido à alta profundidade de foco ao usar um ângulo de convergência baixo. Não há necessidade de refinar a eucentricidade como isso já foi feito antes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Figura 7: Caixa de diálogo de propriedades do arquivo para mapas de resolução média. Salve como um arquivo de pilha MRC, escolha inteiros e salve informações extras em um arquivo de metadados .mdoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Figura 8: Diálogo de configuração de montagem para salvar mapas de resolução média. Para um quadrado em uma grade de 200 malhas, que tem 90 μm de largura, uma área total de pelo menos 90 μm x 90 μm é aconselhável. Escolha Mover estágio em vez de deslocar imagem e Usar parâmetros de exibição no modo de baixa dose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Figura 9: Gravação do mapa de média resolução. Adquira na caixa de diálogo Itens para gravar mapas de média resolução. Escolha Mapeamento, Adquirir e salvar imagem ou montagem e marque Criar mapa do navegador. Em Tarefas antes ou depois da Primária, escolha Eucentricidade Bruta e Fina. Quando estiver sem assistência, escolha opcionalmente Nenhuma caixa de mensagem quando ocorrer um erro e Fechar válvulas de coluna no final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Figura 10: Imagem do mapa de média resolução. Mapa de média resolução (Square Map) gravado no modo STEM por uma montagem de 3 x 3. Os dois Mapas Âncora de média resolução para coleta de dados são indicados pelos quadrados azuis. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Figura 11: Dados da série de inclinação do lote. Adquira na caixa de diálogo Itens para coletar séries de inclinação em lote. Para coleta de dados de séries de inclinação, escolha Dados finais e Adquirir série de inclinação. Em Tarefas antes ou depois da Primária, marque Gerenciar Dewars/Vácuo (escolha as configurações apropriadas no menu Configuração), Realinhar ao Item, Eucentricidade Fina e Executar Script antes da Ação. Nas opções Geral, marque Nenhuma caixa de mensagem quando ocorrer um erro e Fechar válvulas de coluna no final (consulte 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Figura 12: Inclinação de 0° de uma série de inclinação STEM de uma mitocôndria. As pontas de seta alaranjadas apontam para depósitos de fosfato de cálcio (grânulos matriciais), pontas de seta verdes para cristas e pontas de seta vermelhas para marcadores fiduciais de ouro de 15 nm. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Figura 13: Mapas crio-CLEM registrados. (A) O mapa STEM de média resolução (mapa quadrado, 26-A) é registrado no mapa STEM de baixa resolução (B), no mapa crio-FM do canal BF e no mapa crio-FM do canal GFP (D). Os nove pontos de registo (etiquetas 4-21) são apresentados no (E) Navigator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Figura 14: Renderização de volume. Renderização volumétrica de seções de (A) 60 nm e a (B) 40 nm de espessura através de um tomograma filtrado tipo SIRT (30 ciclos) em diferentes profundidades. O tamanho do pixel é de 2,048 nm, o que resulta em um campo de visão de aproximadamente 4 μm. Observe a densidade invertida em comparação com a Figura 12, o que significa que os recursos de alta intensidade são brilhantes. As pontas de seta laranja, branca, vermelha, verde e azul clara apontam para depósitos de fosfato de cálcio, ribossomos, microtúbulos, membrana mitocondrial interna e externa e filamentos de actina, respectivamente. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A tomografia crio-STEM fornece um meio de visualizar organelas de células intactas sem incorporação, seccionamento ou outras preparações invasivas. A resolução 3D obtida está atualmente na faixa de poucos nanômetros, com um campo de visão de vários micrômetros e uma espessura acessível na ordem de 1 μm.

Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

A tomografia por TEM é amplamente utilizada para obtenção de imagens de células, mas é muito limitada em termos de espessura da amostra. A FIB M/ e a tomografia por raios X moles podem ser usadas para amostras maiores, embora com resolução menor. A tomografia STEM preenche perfeitamente essa lacuna.A tomografia STEM fornece uma visão de amostras de mícron de espessura com uma resolução de alguns nanômetros. A combinação com a preparação criogênica nos permite olhar para amostras biológicas e seções em 3D. Revise os conceitos básicos de óptica STEM para entender a formação da imagem e garantir que o engenheiro de serviço alinhou bem os modos de haste e haste Lomax, e que as etapas de calibração se parecem com as do vídeo.Para começar, carregue o arquivo de alinhamento de coluna e abra os valores de coluna. Se estiver usando um suporte cryo de entrada lateral, abra o escudo cryo e inicie no modo TEM. O feixe deve aparecer na tela.Abaixe a ampliação se o feixe não aparecer. Coloque o microscópio em foco eucêntrico pressionando o botão no painel de controle. Defina o tamanho do ponto para um valor conveniente para visualizar a tela fluorescente diretamente ou com a câmera integrada.Ajuste o microscópio para o modo STEM e verifique se o foco usa as lentes condensadoras em vez da objetiva. No painel, defina o foco eucêntrico e saia do modo de difração para os ajustes iniciais. Certifique-se de que o feixe não esteja em branco e reduza a ampliação até que o feixe apareça na tela.Ajuste o deslocamento do feixe para o centro e aumente a ampliação em passos até 70.000, mantendo o feixe no centro. Em seguida, insira a abertura desejada do condensador, normalmente de 50 micrômetros para o modo de micro sonda, e verifique a centralização da abertura. Ao girar o botão de foco para frente e para trás, o ponto deve se expandir e se contrair, mas permanecer no lugar, como se um plano cortasse uma ampulheta vertical imaginária.Se a abertura não estiver centralizada, a iluminação mudará lateralmente como se a ampulheta estivesse inclinada. Coloque o feixe para focar, pressione o foco da lista de intensidade na guia de alinhamentos ou retorne ao foco eucêntrico. Reajuste a posição do feixe para o centro e ajuste o centro de rotação.Agora, gire a roda do passo de foco para o mínimo, ou um degrau acima, para que o feixe pulse suavemente e certifique-se de que ele permaneça estacionário à medida que o foco se move para cima e para baixo. Selecione os pontos dinâmicos e junte os dois pontos com ajustes X e Y. Ajuste os estigmatizadores do condensador para tornar o feixe redondo.Suba e desça através do foco para otimizar. Não deve haver tendência a alongar em uma direção ou outra ao passar pelo foco. Normalize as lentes e, em seguida, aumente a ampliação progressivamente para cerca de 240.000, enquanto usa o deslocamento do feixe para manter o ponto centralizado e repetir os ajustes do centro de rotação e do ponto de pivô.Retorne ao modo de difração. Nesta fase, o feixe deve aparecer como um disco uniforme na tela fluorescente. O comprimento da câmera agora controla efetivamente a distância óptica ao detector como uma cristalografia de raios-x.Mude-o e observe como o disco se contrai e amplia como se a localização da tela se movesse em direção ou para longe do espécime. Este cone representa a iluminação do campo brilhante. Para ativar o modo STEM em alta ampliação, comece com o detector de haste de campo brilhante e ajuste o alinhamento da difração para centralizar o feixe usando o comprimento de câmera desejado.Ligue a marcação de campo brilhante na tela, reduza o comprimento da câmera para 330, levante a tela e insira os detectores. Inicie uma varredura no software do microscópio. Use a tela do escopo para ajudar a ajustar as configurações de brilho e contraste, conforme descrito no manuscrito.Itere o ajuste várias vezes. Retorne o microscópio a uma magnificação relativamente baixa no registro de alta magnificação, sem entrar no modo de baixa magnificação. Insira a tela fluorescente e anote a corrente da tela para referência.Como no TEM, a corrente pode ser alterada com as configurações de lente da arma e tamanho do ponto com números crescentes correspondentes a uma corrente reduzida. Neste ponto, salve um registro FEG para facilitar um retorno aos valores padrão. Vá para o modo LMTEM para ver o espécime.Insira o espécime. Leve a amostra à altura eucêntrica. Existem vários métodos para fazer isso.Por exemplo, use o oscilador de palco para inclinar a grade enquanto move a altura da amostra ao longo do eixo Z até que a imagem pare de se deslocar lateralmente. Como alternativa, marque alguns recursos na tela de visualização e incline o palco para 10 a 30 graus. O recurso se moverá lateralmente.Ajuste a altura do espécime para trazê-lo de volta à sua posição original. Aumente a ampliação ou inclinação do estágio para refinar e retornar a inclinação para zero graus. Agora retorne ao modo STEM e insira o detector STEM.Certifique-se de que ativar a verificação LM esteja desmarcada. Vá para o modo de ampliação alta mais baixo. Ajuste o astigmatismo do condensador pelo método.Com o feixe sobre uma área de amostra fina, concentre-se no ponto onde o feixe transmitido explode entre as imagens de sombra da amostra de ambos os lados. Em seguida, ajuste o ajuste do condensador para tornar o disco central redondo. Isso requer alguma prática, especialmente para amostras criogênicas.Volte para a abertura de 50 micrômetros e atualize o registro FEG. Vá para o modo LMSTEM e continue a varredura para encontrar uma área interessante. Se necessário, reajuste as configurações de brilho e contraste do detector aproximadamente neste ponto.Pressione o foco eucêntrico, aumente a ampliação e refine o foco durante a digitalização usando o laço de foco fornecido pelo microscópio e verifique o astigmatismo em contas de ouro. Até agora, tudo é realizado em modo nano probe. Observe que a inserção de uma abertura menor do condensador diminui o ângulo de semiconvergência, o que é útil para amostras espessas.Uma abordagem alternativa com instrumentos TFS é mudar para o modo de micro sonda, o que leva a um ângulo de semiconvergência reduzido. Em seguida, ajuste o comprimento da câmera para que o ângulo de coleta seja três vezes maior que o ângulo de convergência, ou seja, as marcações da área do detector BF na tela são cerca de três vezes maiores que o feixe.Estimar a dose para registro usando uma equação. Como regra geral, mire de 100 a 150 elétrons por tstrom de tinta quadrada para todo o tomógrafo. Retorne o palco para um todo e ajuste a corrente do feixe usando o tamanho do ponto e ou as configurações da lente da pistola para alcançar a corrente de tela desejada.O mapa de grade de baixa ampliação completo gravado no modo STEM mostra as áreas com células de interesse. As células aparecem parcialmente brilhantes com elétrons espalhados em direção ao detector HAADF. O mapa de média resolução gravado no modo STEM exibia dois mapas âncora de média resolução.A inclinação de zero graus de uma série de inclinação do caule permitiu a visualização dos depósitos de fosfato de cálcio, cristas e marcadores fiduciais de ouro de uma mitocôndria. Renderização de volume de seções de 60 nanômetros e 40 nanômetros de espessura são mostradas. A tomografia de tronco crioterático, ou CSTET, fornece uma ponte entre biologia estrutural e biologia celular, bem como um contexto para fluorescência de superresolução.Sem a necessidade de seccionamento ou preparação de lamelas, podemos ver todo o teatro celular em um estado quase nativo.

visualization-of-organelles-in-situ-by-cryo-stem-tomography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Que vamos mostrar aqui como usar elétron cryotomography (ECT) para estudar a ultra-estrutura das células bacterianas em quase nativo estados, a "macromolecular" (~ 4 nm) resolução.

Electron Cryotomography de células bacterianas

Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

Aqui, é apresentado um protocolo descrevendo as etapas de preparação da amostra e coleta de dados necessárias na tomografia criobada de raios-X (SXT) para a imagem da ultraestrutura de células inteiras preservadas de crio-preservo em uma resolução de 25 nm meio passo.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

Usando fresagem por feixe de íons focalizado para produzir lamelas vítreas on-grid a partir de amostras biológicas congeladas por imersão para tomografia crio-eletrônica.

Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Apresentamos um protocolo para a preparação de lamella de espécimes biológicos congelados por micromaquingia de feixe de íons focado em crio-pia para estudos estruturais de alta resolução de macromoléculas in situ com tomografia crio-elétron. O protocolo apresentado fornece diretrizes para a preparação de lamellae de alta qualidade com alta reprodutibilidade para caracterização estrutural de macromoléculas dentro do Saccharomyces cerevisiae.

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

O objetivo deste protocolo é direcionar a adesão celular e o crescimento para áreas direcionadas de redes para microscopia crio-elétron. Isso é conseguido aplicando uma camada anti-incrustada que é ablada em padrões especificados pelo usuário seguido pela deposição de proteínas de matriz extracelular nas áreas padronizadas antes da semeadura celular.

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

O presente protocolo descreve a aquisição remota de dados remotos crio-elétrons de alta resolução usando Tomo5 e processamento de dados subsequente e média de subtomogramas usando a emClarity. A apoferritina é usada como exemplo para ilustrar processos passo a passo detalhados para alcançar uma estrutura crio-ET com resolução de 2,86 Å.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

A tomografia crioeletrônica (cryo-ET) permite a visualização 3D da ultraestrutura celular com resolução nanométrica, mas a segmentação manual permanece demorada e complexa. Apresentamos um novo fluxo de trabalho que integra software avançado de realidade virtual para segmentar tomogramas crio-ET, mostrando sua eficácia por meio da segmentação de mitocôndrias em células de mamíferos.

Aproveitando a realidade virtual para segmentação imersiva e análise de dados de tomografia crioeletrônica

Este protocolo de vídeo ilustra como realizar a tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes virológicos. Para obter os melhores resultados, as amostras são preparadas por congelamento de alta pressão e subsequente substituição por congelamento.

Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento

Aprenda a técnica de tomografia criogênica por STEM para visualização de organelas em células intactas com resolução nanométrica em amostras de espessura micrométrica.

Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM

Explorar mais vídeos