Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM

A tomografia por TEM é amplamente utilizada para obtenção de imagens de células, mas é muito limitada em termos de espessura da amostra. A FIB M/ e a tomografia por raios X moles podem ser usadas para amostras maiores, embora com resolução menor. A tomografia STEM preenche perfeitamente essa lacuna.

A tomografia STEM fornece uma visão de amostras de mícron de espessura com uma resolução de alguns nanômetros. A combinação com a preparação criogênica nos permite olhar para amostras biológicas e seções em 3D. Revise os conceitos básicos de óptica STEM para entender a formação da imagem e garantir que o engenheiro de serviço alinhou bem os modos de haste e haste Lomax, e que as etapas de calibração se parecem com as do vídeo.

Para começar, carregue o arquivo de alinhamento de coluna e abra os valores de coluna. Se estiver usando um suporte cryo de entrada lateral, abra o escudo cryo e inicie no modo TEM. O feixe deve aparecer na tela.

Abaixe a ampliação se o feixe não aparecer. Coloque o microscópio em foco eucêntrico pressionando o botão no painel de controle. Defina o tamanho do ponto para um valor conveniente para visualizar a tela fluorescente diretamente ou com a câmera integrada.

Ajuste o microscópio para o modo STEM e verifique se o foco usa as lentes condensadoras em vez da objetiva. No painel, defina o foco eucêntrico e saia do modo de difração para os ajustes iniciais. Certifique-se de que o feixe não esteja em branco e reduza a ampliação até que o feixe apareça na tela.

Ajuste o deslocamento do feixe para o centro e aumente a ampliação em passos até 70.000, mantendo o feixe no centro. Em seguida, insira a abertura desejada do condensador, normalmente de 50 micrômetros para o modo de micro sonda, e verifique a centralização da abertura. Ao girar o botão de foco para frente e para trás, o ponto deve se expandir e se contrair, mas permanecer no lugar, como se um plano cortasse uma ampulheta vertical imaginária.

Se a abertura não estiver centralizada, a iluminação mudará lateralmente como se a ampulheta estivesse inclinada. Coloque o feixe para focar, pressione o foco da lista de intensidade na guia de alinhamentos ou retorne ao foco eucêntrico. Reajuste a posição do feixe para o centro e ajuste o centro de rotação.

Agora, gire a roda do passo de foco para o mínimo, ou um degrau acima, para que o feixe pulse suavemente e certifique-se de que ele permaneça estacionário à medida que o foco se move para cima e para baixo. Selecione os pontos dinâmicos e junte os dois pontos com ajustes X e Y. Ajuste os estigmatizadores do condensador para tornar o feixe redondo.

Suba e desça através do foco para otimizar. Não deve haver tendência a alongar em uma direção ou outra ao passar pelo foco. Normalize as lentes e, em seguida, aumente a ampliação progressivamente para cerca de 240.000, enquanto usa o deslocamento do feixe para manter o ponto centralizado e repetir os ajustes do centro de rotação e do ponto de pivô.

Retorne ao modo de difração. Nesta fase, o feixe deve aparecer como um disco uniforme na tela fluorescente. O comprimento da câmera agora controla efetivamente a distância óptica ao detector como uma cristalografia de raios-x.

Mude-o e observe como o disco se contrai e amplia como se a localização da tela se movesse em direção ou para longe do espécime. Este cone representa a iluminação do campo brilhante. Para ativar o modo STEM em alta ampliação, comece com o detector de haste de campo brilhante e ajuste o alinhamento da difração para centralizar o feixe usando o comprimento de câmera desejado.

Ligue a marcação de campo brilhante na tela, reduza o comprimento da câmera para 330, levante a tela e insira os detectores. Inicie uma varredura no software do microscópio. Use a tela do escopo para ajudar a ajustar as configurações de brilho e contraste, conforme descrito no manuscrito.

Itere o ajuste várias vezes. Retorne o microscópio a uma magnificação relativamente baixa no registro de alta magnificação, sem entrar no modo de baixa magnificação. Insira a tela fluorescente e anote a corrente da tela para referência.

Como no TEM, a corrente pode ser alterada com as configurações de lente da arma e tamanho do ponto com números crescentes correspondentes a uma corrente reduzida. Neste ponto, salve um registro FEG para facilitar um retorno aos valores padrão. Vá para o modo LMTEM para ver o espécime.

Insira o espécime. Leve a amostra à altura eucêntrica. Existem vários métodos para fazer isso.

Por exemplo, use o oscilador de palco para inclinar a grade enquanto move a altura da amostra ao longo do eixo Z até que a imagem pare de se deslocar lateralmente. Como alternativa, marque alguns recursos na tela de visualização e incline o palco para 10 a 30 graus. O recurso se moverá lateralmente.

Ajuste a altura do espécime para trazê-lo de volta à sua posição original. Aumente a ampliação ou inclinação do estágio para refinar e retornar a inclinação para zero graus. Agora retorne ao modo STEM e insira o detector STEM.

Certifique-se de que ativar a verificação LM esteja desmarcada. Vá para o modo de ampliação alta mais baixo. Ajuste o astigmatismo do condensador pelo método.

Com o feixe sobre uma área de amostra fina, concentre-se no ponto onde o feixe transmitido explode entre as imagens de sombra da amostra de ambos os lados. Em seguida, ajuste o ajuste do condensador para tornar o disco central redondo. Isso requer alguma prática, especialmente para amostras criogênicas.

Volte para a abertura de 50 micrômetros e atualize o registro FEG. Vá para o modo LMSTEM e continue a varredura para encontrar uma área interessante. Se necessário, reajuste as configurações de brilho e contraste do detector aproximadamente neste ponto.

Pressione o foco eucêntrico, aumente a ampliação e refine o foco durante a digitalização usando o laço de foco fornecido pelo microscópio e verifique o astigmatismo em contas de ouro. Até agora, tudo é realizado em modo nano probe. Observe que a inserção de uma abertura menor do condensador diminui o ângulo de semiconvergência, o que é útil para amostras espessas.

Uma abordagem alternativa com instrumentos TFS é mudar para o modo de micro sonda, o que leva a um ângulo de semiconvergência reduzido. Em seguida, ajuste o comprimento da câmera para que o ângulo de coleta seja três vezes maior que o ângulo de convergência, ou seja, as marcações da área do detector BF na tela são cerca de três vezes maiores que o feixe.

Estimar a dose para registro usando uma equação. Como regra geral, mire de 100 a 150 elétrons por tstrom de tinta quadrada para todo o tomógrafo. Retorne o palco para um todo e ajuste a corrente do feixe usando o tamanho do ponto e ou as configurações da lente da pistola para alcançar a corrente de tela desejada.

O mapa de grade de baixa ampliação completo gravado no modo STEM mostra as áreas com células de interesse. As células aparecem parcialmente brilhantes com elétrons espalhados em direção ao detector HAADF. O mapa de média resolução gravado no modo STEM exibia dois mapas âncora de média resolução.

A inclinação de zero graus de uma série de inclinação do caule permitiu a visualização dos depósitos de fosfato de cálcio, cristas e marcadores fiduciais de ouro de uma mitocôndria. Renderização de volume de seções de 60 nanômetros e 40 nanômetros de espessura são mostradas. A tomografia de tronco crioterático, ou CSTET, fornece uma ponte entre biologia estrutural e biologia celular, bem como um contexto para fluorescência de superresolução.

Sem a necessidade de seccionamento ou preparação de lamelas, podemos ver todo o teatro celular em um estado quase nativo.