Name: Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar o potencial de membrana mitocondrial e níveis de superóxido por imagem de fluorescência em células HeLa. Este método auxilia pesquisadores a investigar disfunção mitocondrial em doenças neurodegenerativas.

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Agradecemos aos membros do laboratório Evans por seu feedback atencioso sobre este manuscrito. Este trabalho é apoiado por Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. A Figura 1A foi confeccionada com BioRender.com.

Quantificação do potencial da membrana mitocondrial e dos níveis de superóxido

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in innate immune responses.</a> Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).</li>
<li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+MAVS%2C+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122 (5), 669-682 (2005).</li>
<li>Tait, S. W. G., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cell signalling.</a> Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).</li>
<li>Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).</li>
<li>Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+complex+role+of+mitochondria+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease.</a> Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).</li>
<li>Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Parkinson%27s+disease%3A+clinical%2C+molecular%2C+and+translational+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects.</a> Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).</li>
<li>Ou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+in+the+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+of+Parkinson%27s+disease+in+204+countries%2Fterritories+from+1990+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019.</a> Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).</li>
<li>Martinez-Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mitophagy+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).</li>
<li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li>
<li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Parkin+zone%3A+mitophagy+without+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">No Parkin zone: mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).</li>
<li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PINK1%2FParkin-mediated+mitophagy+is+compromised+by+PD-associated+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations.</a> Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).</li>
<li>Kane, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+phosphorylates+ubiquitin+to+activate+Parkin+E3+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).</li>
<li>Koyano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+is+phosphorylated+by+PINK1+to+activate+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin.</a> Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).</li>
<li>Ordureau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+roles+of+PARKIN+and+ubiquitin+phosphorylation+by+PINK1+in+mitochondrial+quality+control+using+a+ubiquitin+replacement+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).</li>
<li>Ordureau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveal+a+feedforward+mechanism+for+mitochondrial+PARKIN+translocation+and+ubiquitin+chain+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis.</a> Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).</li>
<li>Kitada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+parkin+gene+cause+autosomal+recessive+juvenile+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism.</a> Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).</li>
<li>Valente, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK6+is+a+common+cause+of+familial+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PARK6 is a common cause of familial parkinsonism.</a> Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li>
<li>Sriram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial-associated+mutations+differentially+disrupt+the+solubility%2C+localization%2C+binding+and+ubiquitination+properties+of+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin.</a> Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).</li>
<li>Vives-Bauza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+recruitment+of+Parkin+to+mitochondria+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).</li>
<li>Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optineurin+is+an+autophagy+receptor+for+damaged+mitochondria+in+parkin-mediated+mitophagy+that+is+disrupted+by+an+ALS-linked+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).</li>
<li>Bertolin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+maintains+mitochondrial+levels+of+the+protective+Parkinson%27s+disease-related+enzyme+17-beta+hydroxysteroid+dehydrogenase+type+10%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10.</a> Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+production+under+cellular+stress%3A+comparison+of+different+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).</li>
<li>Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+and+activation+of+ALS-associated+TBK1+with+its+target+optineurin+are+required+for+efficient+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).</li>
<li>Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+engulfed+mitochondria+is+rate-limiting+in+Optineurin-mediated+mitophagy+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons.</a> eLife. 9, e50260(2020).</li>
<li>Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FuGENE+6+Transfection+Reagent%3A+the+gentle+power%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power.</a> Methods. 33 (2), 104-112 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).</li>
<li>Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mitochondria+infusion+mitigates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats.</a> Shock. 39 (3), 304-310 (2013).</li>
<li>Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mitochondria+infusion+mitigates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+liver+in+rats%3A+mitotracker+probes+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential.</a> Shock. 39 (6), 543(2013).</li>
<li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li>
<li>Pavel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+controls+cell+survival+and+proliferation+via+YAP%2FTAZ-autophagy+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis.</a> Nature Communications. 9 (1), 2961(2018).</li>
<li>Rossignol, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).</li>
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<li>Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+based+assays+for+the+measurement+of+apoptosis-associated+mitochondrial+membrane+depolarisation+and+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release.</a> Methods. 61 (2), 138-145 (2013).</li>
<li>Muller, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+extracellular+flux+analysis+for+determining+mitochondrial+function+in+mammalian+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16778(2019).</li>
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<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
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<li>Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances.</a> Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).</li>
<li>Middleton, P., Vergis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+liver+disease%3A+role%2C+relevance%2C+and+potential+for+therapeutic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation.</a> Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394(2021).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência30. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais eram esp...

A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia1, imunidade inata 2,3 e sinalização celular 4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo omundo8. A DP tem sido geneticamente ligada à mitofagia, uma via de controle de qualidade mitocondrial necessária para a manutenção da homeostase celular que remove seletivamente as mitocôndrias danificadas 9,10. Estudos identificaram múltiplas vias de mitofagia independentes, incluindo o domínio FUN14 contendo 1 mitofagia mediada por FUNDC1, mitofagia facilitada pela proteína de interação Bcl-2 3 (BNIP3), mitofagia dependente de NIX e a bem caracterizada quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (uma suposta quinase) e Parkin (uma ubiquitina ligase E3) trabalham em conjunto com mitocôndrias danificadas por fosfo-ubiquitinato, o que impulsiona a formação de autofagossomos que engolem a organela danificada e se fundem com lisossomos para iniciar a degradação 12,13,14,15,16. Mutações em Parkin têm sido associadas a fenótipos ligados à DP, como a neurodegeneração via perda de neurônios dopaminérgicos17,18.
Aqui, é descrito um protocolo no qual células HeLa, rotineiramente usadas como células imortalizadas derivadas do câncer cervical, são usadas para investigar o papel de Parkin na manutenção da saúde da rede mitocondrial. As células HeLa expressam níveis desprezíveis de Parkin endógeno e, portanto, requerem expressão exógena de Parkin19. Para estudar o papel de Parkin na saúde da rede mitocondrial, as células HeLa são transfectadas com Parkin selvagem (ParkinWT), um mutante Parkin (ParkinT240R) ou um vetor de controle vazio. ParkinT240R é uma mutação autossômica recessiva do parkinsonismo juvenil que afeta a atividade da ligase Parkin E3, reduzindo significativamente a eficiência da via mitofágica20. As células HeLa estão sujeitas a concentrações leves (5 μM) ou severas (20 μM) de cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. O tratamento com concentrações severas de CCCP é rotineiramente utilizado para induzir mitofagia mediada por Parkin em várias linhagens celulares, como células HeLa e COS-721,22,23.
Após o tratamento, o protocolo emprega imagens ao vivo da rede mitocondrial usando dois corantes fluorescentes direcionados para mitocôndrias atualmente disponíveis. A tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) é um corante catiônico que fluoresce com base no potencial de membrana mitocondrial24, enquanto a MitoSOX é um indicador de superóxido mitocondrial onde a intensidade da fluorescência é função da concentração de superóxido25. Finalmente, o protocolo delineado usa uma quantificação baseada em fluorescência e fluxo de trabalho simples para quantificar efetivamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido com escopo mínimo para viés do usuário. Embora este protocolo tenha sido desenhado para estudar a função mitocondrial em células HeLa, ele pode ser adaptado para linhagens celulares adicionais e tipos celulares primários para caracterizar quantitativamente a saúde da rede mitocondrial.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos, Peptídeos e Proteínas Recombinantes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCCP (carbonilcianeto m-clorofenil hidrazona)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) com 4,5 g/L de glicose</td><td>Gibco</td><td>11-965-084</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anidro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 (Reagente de Tranfecção)</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x (Solução L-Glutamina)&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&nbsp; Vermelho&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Vermelho Escuro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Meio de soro reduzido)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, Éster Etílico, Perclorato (TMRE)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T669</td><td></td></tr><tr><td>Modelos experimentais: Organismos/Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-M (Homo sapiens)</td><td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA recombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EYFP Vetor Vazio N</td><td>/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin T240R</td><td>Este artigo</td><td>foi gerado por mutagênese dirigida ao local de YFP-Parkin</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin WT</td><td>Addgene; PMID:19029340</td><td>RRID:Addgene_23955</td><td></td></tr><tr><td>Software e Algoritmos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe Inc.</td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td><td>(Schindelin, 2012)</td></tr><tr><td>Excel (Software de Planilha)</td><td>Microsoft Office&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td><td></td></tr> <tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td>https://www.microsoft.com/excel</td><td></td></tr><tr><td>Prism9 (Estatístico Software de análise)</td><td>Software GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr><tr><td>Outro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Prato, lamínula nº 1,5, diâmetro de vidro de 20 mm, incubadora</td> de gaiola <td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td>não revestida</tr><tr><td>(câmara ambiental)</td>Microscópio invertido <td>Okolab</td><td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td><td></td></tr><tr><td>DMiL</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LIGHTNING Software de deconvolução</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>STELLARIS 8 microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação baseada em fluorescência do potencial de membrana mitocondrial e níveis de superóxido usando imagem viva em células hela

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (ParkinT240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.

Neste protocolo, a quantificação baseada em fluorescência foi utilizada para medir o potencial de membrana e os níveis de superóxido da rede mitocondrial após o tratamento com CCCP (Figura 1). Esse fluxo de trabalho usou células HeLa, uma linhagem celular imortalizada derivada do câncer cervical. As células HeLa são rotineiramente usadas para estudar a biologia mitocondrial e são relativamente planas, facilitando a visualização da rede mitocondrial usando microscopia. Para investigar o papel...

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Esta pesquisa enfoca a desregulação mitocondrial em doenças neurodegenerativas. Acreditamos que esta pesquisa pode ser usada para entender causas potenciais para o aparecimento de doenças que podem levar a terapêuticas que combatem doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e a ELA. Técnicas como microscopia de superresolução como STED e SIM ou microscopia de expansão melhoraram a capacidade de entender com precisão a distribuição de proteínas dentro de organelas individuais e a distribuição de mitocôndrias por toda a célula.Os resultados desta técnica podem ser usados como ponto de partida para estudar o efeito das mutações ligadas à doença de Parkinson sobre o turnover mitocondrial e começar a entender a importância de regular os níveis de espécies reativas de oxigênio e o potencial da membrana mitocondrial para manter a saúde neuronal. Nosso laboratório tem como objetivo caracterizar mecanisticamente as vias individuais de controle de qualidade mitocondrial para entender a interação entre essas vias. Ao ter insights sobre a dinâmica das vias, pode-se entender como as mitocôndrias são mantidas e como a desregulação mitocondrial contribui para o aparecimento de doenças neurodegenerativas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

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Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa (Vídeo) | JoVE Journal

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

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