in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais
March 1st, 2024
O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.
Nossa pesquisa se concentra nos neurônios e nos circuitos do sistema somatossensorial envolvidos na narração dos efeitos analgésicos da acupuntura na dor visceral enquanto tentamos ajustar as respostas dos neurônios do neuro DRG aos estímulos da acupuntura. Os métodos tradicionais, como a eletrogravação, não podem examinar com eficiência o número de células suficiente e os laços celulares específicos distintos para identificar os neurônios responsivos viscerais ou somáticos in vivo. Estudar os papéis funcionais do neurônio DRG no efeito analgésico da acupuntura tem sido difícil devido a restrições tecnológicas.
Introduzimos uma abordagem geral para observar a responsabilidade de um neurônio DRG número seis para simulação intracolônica e acupuntura in vivo. O protocolo descreve os procedimentos para observar a atividade dos neurônios DRG in vivo em resposta à entrada somática e vísceras. Esta é uma melhoria em relação ao estudo anterior, que se concentrou apenas no levantamento das respostas dos neurônios no DRG L5 sob os estímulos somáticos.
No futuro, com a configuração correta, a imagem CAS DRG in vivo pode ser feita em segmentos torácicos ou cervicais, fornecendo uma ferramenta mais poderosa para estudar os efeitos da nocicepção visceral e da acupuntura. Este método é essencial para os pesquisadores de acupuntura aprenderem. Para começar, coloque o camundongo traqueostomizado na posição de bruços na almofada de aquecimento.
Faça uma incisão na linha média de sete centímetros de comprimento na parte inferior das costas e estenda-a da quinta vértebra lombar até a primeira vértebra sacral. Em seguida, afaste cuidadosamente os músculos longuíssimo lombar para expor os processos espinhosos das três vértebras. Mova as partes internas do longuíssimo lombar bilateral, músculos dorsais da coluna lombar e músculos dorsais da semiespinha lombar para expor os três processos articulares e mamilares sucessivos com o segmento de registro no meio das vértebras.
Agora, imobilize com segurança o animal com pinça dentária nos processos articulares bilaterais das vértebras vizinhas. Use uma pinça rongeur para remover os processos articulares e mamilares esquerdo ou direito das quatro ou seis vértebras lombares. Exponha cuidadosamente os seis DRG lombares esquerdo ou direito depois de limpar os tecidos conjuntivos acima dele.
Certifique-se de manter o epineuro intacto no lado escolhido das seis vértebras lombares. Cubra as áreas expostas do DRG com pequenas bolas de algodão embebidas em solução salina para manter a condição ativa. Agora, conecte o sistema de administração de anestesia de baixo fluxo à cânula traqueal para intubar os camundongos.
Posicione o animal com o DRG exposto em uma almofada de aquecimento situada no palco de uma pinça espinhal personalizada. Usando dois grampos nas colunas vertebrais das vértebras vizinhas, prenda o animal para minimizar o movimento durante o teste. Em seguida, substitua as bolas de algodão umedecidas com solução salina até que a área cirúrgica esteja adequadamente limpa.
Insira o grampo espinhal personalizado no microscópio personalizado Para imagens, posicione uma lente objetiva de ar de longa distância de trabalho de um microscópio confocal sobre o DRG exposto. Capture pilhas Z com lapso de tempo do DRG lombar intacto de quatro ou seis com 25 micrômetros por passo e resolução de 512 por 512 ou 1.024 por 1.024 pixels.
Realize a varredura XYZT do DRG com quatro a oito pilhas, abrangendo um a três estados basais, dois a três estímulos de acupuntura ou distensão colorretal visceral e um a dois estados pós-estímulos. Em seguida, aplique estímulos de escovação ou pinçamento na parte inferior das costas, membro posterior ou pata traseira do animal para avaliar o campo receptivo mais sensível dos neurônios DRG imageados. Administre estímulos de acupuntura manualmente ou usando um ponto de acupuntura e estimulador de nervo disponíveis comercialmente.
Empregue a distensão colorretal com um manômetro de pressão de ar de fabricação própria para induzir estímulos viscerais. Usando um microscópio confocal, meça o aumento da fluorescência verde do GCaMP neuronal ao se ligar ao cálcio intracelular após estímulos somáticos ou viscerais. Usando o software de imagem, clareie o vídeo usando a opção de cor.
Delineie manualmente as células visíveis e determine o tamanho da célula e a intensidade relativa da fluorescência. Expresse a intensidade da fluorescência como uma razão entre o aumento da fluorescência máxima evocada e o nível basal. Os seis neurônios DRG lombares geralmente não possuem fluorescência GFP basal, possivelmente influenciada pelos níveis de expressão de GCaMP e danos cirúrgicos.
Os estímulos de distensão colorretal induziram um aumento rápido e transitório na fluorescência do GCaMP. Respostas semelhantes foram observadas com a aplicação de eletroacupuntura BL25. Mapas de calor e gráficos de linhas mostraram respostas de todos os neurônios circulados à distensão colorretal e eletroacupuntura BL25.
O histograma mostra os diâmetros dos neurônios responsivos à distensão colorretal e à eletroacupuntura BL25.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo detalhado para imagem de cálcio in vivo para avaliar as respostas dos neurônios do gânglio da raiz dorsal lombar-6 (DRG) a estímulos somáticos e viscerais. O método permite uma análise comparativa das respostas neuronais a vários estímulos, melhorando nossa compreensão dos mecanismos da dor visceral e dos efeitos das intervenções somáticas, como a acupuntura.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre Dor
- Neuroimagem
Fundamento
- Os métodos tradicionais de registro elétrico são insuficientes para examinar números suficientes de células in vivo.
- O estudo aborda os desafios em observar os papéis funcionais dos neurônios do DRG em contextos de dor visceral.
- A abordagem melhora as técnicas anteriores que se concentraram principalmente nos neurônios DRG L5.
- Avanços tecnológicos permitem a observação detalhada das respostas da acetilcolina relacionadas à acupuntura e estímulos viscerais.
Objetivo do Estudo
- Investigar a responsividade dos neurônios DRG lombar-6 a estímulos somáticos e viscerais.
- Elucidar os mecanismos subjacentes aos efeitos analgésicos da acupuntura.
- Desenvolver um protocolo confiável para imagem in vivo da atividade de neurônios DRG.
Métodos Utilizados
- Imagem de cálcio de preparações in vivo, especificamente neurônios DRG lombar-6.
- O modelo envolve camundongos traqueostomizados, que são submetidos à exposição cirúrgica do DRG lombar.
- Imagem em tempo real captura respostas neuronais a estímulos somáticos e viscerais.
- Os procedimentos incluem a colocação de eletrodos, métodos de estimulação e técnicas de imagem com microscopia confocal.
- A imagem de timelapse captura respostas de sinalização de cálcio a vários estímulos.
Principais Resultados
- A distensão colorretal e a eletroacupuntura levaram a aumentos rápidos na fluorescência GCaMP, indicando ativação neuronal.
- As respostas foram avaliadas quantitativamente através da intensidade de fluorescência, revelando insights importantes sobre mudanças na excitabilidade neuronal.
- Mapas de calor demonstraram as respostas diferenciais dos neurônios a estímulos somáticos versus viscerais.
- Os resultados informam sobre as dinâmicas celulares envolvidas na nocicepção visceral.
Conclusões
- Este estudo confirma a utilidade do protocolo na exploração das respostas neuronais à acupuntura e estímulos de dor visceral.
- O método de imagem fornece uma ferramenta poderosa para pesquisas futuras sobre os mecanismos da dor e da acupuntura.
- Os resultados melhoram a compreensão da sinalização nociceptiva, potencialmente influenciando estratégias terapêuticas para o manejo da dor.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
In vivo calcium imaging of dorsal root ganglia (DRG) neurons enables direct, quantitative assessment of neuronal ensemble responses to somatic and visceral stimuli in intact animal models. This approach advances mechanistic de-risking for pain pathway research and supports predictive confidence in target validation for sensory and nociceptive signaling. The method is strategically positioned to inform early discovery and translational research on pain modulation and intervention mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sensory neuron activation in response to defined somatic and visceral inputs.
- Supports biological de-risking by distinguishing modality-specific neuronal populations.
- Facilitates functional target validation for pain and sensory pathway research.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal systems for downstream pharmacological or genetic screening.
- Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts for assay standardization.
- Enables comparative evaluation of compound or intervention effects on neuronal activity.
- Supports scalability and platform reuse for sensory neuron assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neuronal response profiles with disease-relevant pain models and interventions.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of analgesic strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for pain and sensory modulation programs.
- Provides mechanistic insights into segmental and modality-specific pain pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational pain research.
- Discovery Biology: Quantifies neuronal activation to clarify sensory pathway mechanisms and de-risk target hypotheses.
- Screening: Establishes assay readiness with reproducible, quantitative calcium imaging outputs.
- Analytics: Provides fluorescence intensity measurements and heat maps for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects neuronal ensemble data to disease-relevant pain and intervention models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to various spinal segments and stimuli types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pain pathway research.
- Operational Value: Standardizes neuronal activity measurement and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in early-stage pain research.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of sensory and analgesic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical exposure and in vivo imaging of DRG neurons.
- Demands access to confocal microscopy and specialized imaging software.
- Necessitates cross-team standardization of stimulus protocols and data analysis.
- Adaptable to different spinal segments and stimulus modalities with protocol modifications.
- Potential limitations include technical complexity and need for animal model infrastructure.
