Aplicações microfluídicos para diagnóstico descartáveis

Meu nome é Catherine CloudBridge e sou professora de manufatura, engenharia e engenharia biomédica na Universidade de Boston. E sou o diretor do Laboratório de Microdispositivos Biomédicos e Microambientes. Trabalhamos principalmente na realização de diagnósticos descartáveis para aplicações em ambientes com recursos limitados.

Então, usamos microfluídica para fazer esses dispositivos. Na verdade, estamos interessados em dois campos de estudo. Principalmente, estamos interessados em observar como as biomoléculas e células interagem com as superfícies de polímeros plásticos.

Esse é o nosso principal guarda-chuva. Esse trabalho está incorporado em aplicações microfluídicas para diagnósticos descartáveis. Então, no laboratório, o que fazemos são dispositivos microfluídicos.

Em materiais termoplásticos que não usamos, normalmente usamos PDMS, que é o material emborrachado que a maioria das pessoas usa para fazer microfluídica em laboratório. Fabricamos nossos dispositivos com termoplásticos. Estamos interessados em usar esses dispositivos termoplásticos para fazer biologia molecular em microescala de tal forma que a biologia molecular possa ser feita no campo, longe de um laboratório centralizado.

Como isso funciona, no laboratório, estamos fazendo pequenos cartões de plástico e dentro desses pequenos cartões de plástico estão colunas de extração de fase sólida ou colunas de lise celular ou colunas de mistura. Também fazemos reação em cadeia da polimerase no chip como técnica de detecção. Todas essas coisas são integradas em um pequeno dispositivo que, eventualmente, na perspectiva de longo prazo da pesquisa, acabaria sendo um dispositivo integrado que poderia ser portátil e levado para o campo ou em ambientes onde um laboratório de grande escala com todas as fusões de centros de atendimento e incubadoras de aquecimento e assim por diante não estaria disponível.

Então, gostaríamos de poder começar com uma amostra humana, como fezes de urina com sangue ou um cotonete nasofaríngeo, por exemplo, que seria muco. E então, na saída do chip, temos uma resposta, seja sim ou não, alguém está infectado com um microorganismo específico. E a maneira como fazemos isso é procurando o DNA desse específico ou RNA, dependendo do microrganismo desse microrganismo específico na amostra do paciente.

Portanto, os desafios técnicos que surgem estão em grande parte no lado da preparação da amostra dessa equação. Então, quando você está começando com sangue, fezes ou urina, você tem que sair de uma situação em que você tem uma amostra humana bagunçada com muitas partículas potencialmente ou inibidores de PCR ou outras técnicas de amplificação. E você quer terminar o final com uma amostra muito limpa e iludida de ácidos nucléicos que você pode usar para amplificar ou procurar um DNA ou RNA específico que lhe dirá se um microorganismo que você está procurando estava lá.

Então, para limpar essas amostras, você precisa fazer algumas coisas. Primeiro, você deve filtrar a amostra, o que, dependendo da amostra, pode envolver filtragem de curso ou uma etapa de centrifugação rápida antes que a amostra vá para o chip. Portanto, sempre tentamos começar com as amostras que vêm do médico.

Portanto, com urina, fezes e swabs nasofaríngeos, nosso objetivo é apenas fazer com que o médico faça seu trabalho como faria normalmente e colete a amostra como faria normalmente. E então pegamos essa amostra e a colocamos nos chips. Então, se mais alguma filtragem precisar acontecer nessa etapa, essa filtragem aconteceria no chip.

A segunda etapa envolve, como estamos fazendo ensaios moleculares, temos que lisar as células e os microrganismos que estão nessa amostra. Então, realizamos uma etapa de lise, que geralmente envolve forçar a amostra através de um filtro que tem um tamanho de poro pequeno. Às vezes, esse filtro também contém nanopartículas como nanotubos de carbono, que têm bordas afiadas, que podem ser usadas para separar alguns dos organismos que possuem paredes celulares mais robustas, como C difficile, que é uma bactéria gram-positiva com a qual trabalhamos, o que é muito difícil de mentir.

Portanto, temos que ter colunas de lise mais robustas. Mas normalmente estamos fazendo uma lise química e mecânica combinada dentro do chip. Depois disso, nosso objetivo é pegar o lisado e depois extrair os ácidos nucléicos purificados.

Então, passamos a lise, passamos o lisado sobre uma coluna de extração em fase sólida que é ressonante no chip microfluídico. E essa coluna de extração em fase sólida é feita de plástico e é feita usando química iniciada por foto dentro do canal microfluídico depois de já ter sido fabricada. E também é impregnado com partículas de sílica porque queremos ligar e liberar ácidos nucléicos.

Em alguns casos, incorporamos grânulos oligo DT se quisermos ligar e liberar mRNA especificamente, por exemplo, ou grânulos que têm anticorpos específicos, se quisermos ligar e liberar proteínas específicas. E podemos fazer colunas de extração que fazem todas essas coisas. Mas hoje vamos mostrar como fazer a coluna de extração de sase com as esferas de sílica.

Então, depois de fazermos isso, passe o lisado sobre a coluna de sílica, funciona exatamente como um kit de kyogen funcionaria no laboratório em escala macro. Em seguida, lavamos para nos livrar de todas as outras coisas que não queremos, todos os carboidratos e lipídios e outras coisas no lisado celular e no resto da amostra humana que não queremos. E então, no final, estamos aludindo à água.

E o que é bom sobre essas colunas de extração em fase sólida em microescala é que podemos eluir com uma quantidade muito pequena de água, geralmente da ordem de um a cinco microlitros. E estamos recebendo de volta quase todos os ácidos nucléicos que colocamos. Temos uma taxa de eficiência de cerca de 70 a 90% e os primeiros 10 microlitros que recuperamos desse canal.

Então, se lavarmos duas vezes com dois a 10 microlitros, recuperamos quase todos os ácidos nucléicos que colocamos lá. Portanto, não é apenas uma amostra limpa que pode ser PCR, é também uma amostra muito mais concentrada do que você seria capaz de obter com um kit de bancada padrão. Portanto, o objetivo final de todas essas técnicas de preparação de amostras é fazer coisas que sejam compatíveis com alguns dos outros trabalhos que as pessoas fizeram.

Muito bom trabalho em campo mostrando que você pode fazer amplificação de PCR em um chip. Você pode fazer a reação de transcriptase reversa em um chip se estiver lidando com um vírus de RNA ou se quiser fazer um experimento de expressão gênica. Nossas técnicas de preparação de amostras podem ser acopladas diretamente ao PCR em um chip, para que você não precise fazer nenhuma limpeza e preparação de amostras na bancada.

E, e, e também a etapa de concentração que você precisaria fazer para obter os pequenos volumes necessários para fazer PCR multiplexado em um pequeno chip. Portanto, os experimentos que mostraremos hoje estão mostrando como montamos o chip microfluídico, que é feito de termoplástico e não de PDMS. Portanto, requer um processo de fabricação um pouco diferente do normalmente usado, como esses chips são selados.

E então como fazemos a química iniciada pela luz dentro do chip para fazer os monólitos de polímero que são usados tanto para lise celular quanto para extração em fase sólida. E no final desse processo, que agora são processos modulares no laboratório, mas eles podem e foram integrados, fornecem no final uma amostra altamente concentrada de ácidos nucléicos, RNA e DNA na água, que pode então ir a jusante para um módulo de PCR ou outro módulo de amplificação onde a identificação de um microrganismo ou uma infecção pode ocorrer. Então, na verdade, temos uma bolsa na qual estamos trabalhando agora, onde temos, estamos começando a coletar amostras humanas do Boston Medical Center de pacientes que podem ou não estar infectados com Influenza A.So já que é temporada de gripe, essas são as amostras que estamos coletando.

E então, no laboratório, estamos fazendo os ensaios padrão-ouro para verificar se alguém está ou não infectado com Influenza A, que é basicamente um ensaio de cultura, que leva vários dias para ser realizado. E lado a lado com isso, estamos colocando essas amostras em nossos, agora, os módulos do nosso chip. Então, nós os colocamos na coluna de lise, nós os colocamos na coluna de extração em fase sólida e, em seguida, realizamos a PCR para ver o quão bem nos saímos em comparação com os métodos padrão-ouro.

Então esse é o estágio em que estamos agora. Se esses experimentos derem certo, acho que nos próximos, você sabe, quatro a seis anos, talvez estejamos em uma situação em que tenhamos um chip integrado e um ensaio completo para influenza A e também estejamos trabalhando em amostras de clostridium difficile e fezes. E estamos, estamos, também estamos muito perto de ter não apenas o dispositivo integrado, mas também o ensaio integrado.

Portanto, tanto o desenvolvimento do ensaio quanto o design do chip devem acontecer de mãos dadas. Então, para uma aplicação específica, chegar à beira do leito, é realmente um processo orientado a um alvo. Você tem que saber, você sabe, a amostra com a qual está começando e o microrganismo que está procurando para otimizar o chip para uso à beira do leito.

Então, eu, eu não acho que estamos tão longe de fazer isso acontecer de uma maneira de protótipo. Esses são nossos objetivos finais, então espero que cheguemos lá.