Aplicações microfluídicos para diagnóstico descartáveis

Meu nome é Catherine CloudBridge e sou professora de manufatura, engenharia e engenharia biomédica na Universidade de Boston. Também sou diretora do Laboratório de Microdispositivos e Microambientes Biomédicos. Trabalhamos principalmente no desenvolvimento de diagnósticos descartáveis para aplicações em ambientes com recursos limitados.

Portanto, utilizamos microfluídica para fabricar esses dispositivos. Estamos interessados em duas áreas de estudo. Principalmente, queremos investigar como biomoléculas e células interagem com superfícies poliméricas de plástico.

Esse é o nosso principal guarda-chuva. Esse trabalho se concretiza em aplicações microfluídicas para diagnósticos descartáveis. Assim, no laboratório, o que fabricamos são dispositivos microfluídicos.

Em materiais termoplásticos, não utilizamos, tipicamente, PDMS, que é o material elástico que a maioria das pessoas usa para fabricar microfluídica no laboratório. Fabricamos nossos dispositivos a partir de termoplásticos. Estamos interessados em usar esses dispositivos termoplásticos para realizar biologia molecular em microescala, de forma que essa biologia molecular possa ser realizada em campo, distante de um laboratório centralizado.

Como isso funciona no laboratório é que estamos produzindo pequenos cartões plásticos e, no interior desses pequenos cartões plásticos, há colunas de extração em fase sólida, colunas de lise celular ou colunas de mistura. Também realizamos a reação em cadeia da polimerase no chip como técnica de detecção. Todas essas etapas são integradas em um dispositivo pequeno que, numa perspectiva de longo prazo da pesquisa, acabaria se tornando um dispositivo integrado, portátil, que poderia ser levado para o campo ou para ambientes onde um laboratório de grande escala, com todas as centrífugas, incubadoras de aquecimento e outros equipamentos associados, não estivesse disponível.

Portanto, gostaríamos de poder, idealmente, começar com uma amostra humana, como sangue, urina, fezes ou um swab nasofaríngeo, por exemplo, que seria muco. E então, na saída do chip, obter uma resposta se sim ou não, a pessoa está infectada com um determinado microrganismo. E a forma como fazemos isso é procurando o DNA ou RNA desse microrganismo específico, dependendo do microrganismo, na amostra do paciente.

Assim, os desafios técnicos que surgem estão principalmente relacionados à preparação da amostra nesse processo. Quando se parte de sangue, fezes ou urina, é necessário passar de uma situação em que se tem uma amostra humana complexa, com muitas partículas potenciais ou inibidores da PCR ou de outras técnicas de amplificação, para outra em que se obtém uma amostra eluída muito pura de ácidos nucleicos, que possa então ser usada para amplificar ou detectar um DNA ou RNA específico, indicando se o microrganismo procurado estava presente.

Portanto, para limpar essas amostras, é necessário realizar algumas etapas. Primeiro, é preciso filtrar a amostra, o que, dependendo do tipo de amostra, pode envolver uma filtração grossa ou uma centrifugação rápida antes da aplicação na placa. Assim, sempre tentamos iniciar com amostras tal como recebidas do clínico.

Portanto, com urina, fezes e swabs nasofaríngeos, nosso objetivo é que o clínico realize seu trabalho como normalmente faria, coletando a amostra da maneira habitual. Em seguida, nós pegamos essa amostra e a colocamos nos chips. Assim, se for necessária alguma filtração adicional nesse passo, ela ocorrerá dentro do chip.

O segundo passo envolve, como estamos realizando ensaios moleculares, a necessidade de lisar as células e os microrganismos presentes nessa amostra. Assim, realizamos então uma etapa de lise, que geralmente consiste em forçar a amostra através de um filtro com tamanho de poro pequeno. Às vezes, esse filtro também contém nanopartículas, como nanotubos de carbono, que possuem bordas afiadas e podem ser usadas para romper alguns dos organismos que têm paredes celulares mais resistentes, como o C difficile, uma bactéria gram-positiva com a qual trabalhamos e que é muito difícil de lisar.

Portanto, precisamos de colunas de lise mais robustas. Mas normalmente realizamos uma lise química e mecânica combinada dentro do chip. Após isso, nosso objetivo é coletar o lisado e então extrair os ácidos nucleicos purificados.

Então, passamos a lisado sobre uma coluna de extração em fase sólida que é integrada ao chip microfluídico. Essa coluna de extração em fase sólida é feita de plástico e produzida por meio de química iniciada por luz dentro do canal microfluídico, após sua fabricação. Além disso, ela é geralmente impregnada com partículas de sílica, pois desejamos ligar e liberar ácidos nucleicos.

Em alguns casos, incorporamos microesferas com oligo DT se desejarmos ligar e liberar especificamente o mRNA, por exemplo, ou microesferas que possuem anticorpos específicos, caso queiramos ligar e liberar proteínas particulares. E podemos fabricar colunas de extração que realizam todas essas funções. Mas hoje vamos mostrar como fabricar a coluna de extração sase com as microesferas de sílica.

Após fazermos isso, passe o lisado pela coluna de sílica; o processo funciona exatamente como um kit kyogen funcionaria em laboratório em escala macro. Em seguida, realizamos a lavagem para remover todas as substâncias indesejadas, como carboidratos, lipídeos e outros componentes presentes no lisado celular e na amostra humana restante que não queremos. E, no final, eluímos com água.

E o que é interessante nesses microcolunas de extração em fase sólida é que podemos eluir com uma quantidade muito pequena de água, geralmente na ordem de um a cinco microlitros. E estamos recuperando quase todos os ácidos nucleicos que colocamos. Temos uma taxa de eficiência de cerca de 70 a 90% nos primeiros 10 microlitros recuperados desse canal.

Portanto, se realizarmos duas lavagens com dois a dez microlitros, recuperamos quase todos os ácidos nucleicos que colocamos ali. Assim, não se trata apenas de uma amostra limpa e compatível com PCR, mas também de uma amostra muito mais concentrada do que seria possível obter com um kit padrão de bancada. O objetivo final de todas essas técnicas de preparação de amostras é produzir materiais compatíveis com outros trabalhos já realizados por pesquisadores.

Excelente trabalho no campo, demonstrando que é possível realizar amplificação por PCR em um chip. É possível realizar a reação de transcriptase reversa em um chip se estiver lidando com um vírus de RNA ou se desejar realizar um experimento de expressão gênica. Nossas técnicas de preparo de amostras podem ser acopladas diretamente à PCR em um chip, de modo que não seria necessário realizar nenhuma dessas etapas de purificação e preparo de amostras na bancada.

E, além disso, a etapa de concentração que seria necessária para obter os pequenos volumes exigidos para realizar PCR multiplexada em um chip pequeno. Assim, os experimentos que mostraremos hoje demonstram como montamos o chip microfluídico, que é feito de termoplástico e não de PDMS. Por isso, exige um processo de fabricação um pouco diferente do normalmente utilizado, bem como o método de selagem desses chips.

E então como realizamos a química iniciada por luz no interior do chip para produzir monolitos poliméricos que são utilizados tanto para lise celular quanto para extração em fase sólida. E ao final desse processo, que atualmente são processos modulares no laboratório, mas que podem e já foram integrados, obtemos uma amostra altamente concentrada de ácidos nucleicos, RNA e DNA em água, que pode então ser encaminhada a um módulo de PCR ou outro módulo de amplificação, onde pode ocorrer a identificação de um microrganismo ou de uma infecção. Assim, temos na verdade uma subvenção na qual estamos trabalhando atualmente, na qual já começamos a coletar amostras humanas do Boston Medical Center de pacientes que podem ou não estar infectados com Influenza A. Como é a temporada de gripe, essas são as amostras que estamos coletando.

Em seguida, no laboratório, realizamos os ensaios padrão-ouro para verificar se uma pessoa está infectada pelo Influenza A, que basicamente consiste em um ensaio de cultura, o qual leva vários dias para ser realizado. Paralelamente a isso, submetemos essas amostras aos módulos do nosso chip. Assim, passamos as amostras pela coluna de lise, depois pela coluna de extração em fase sólida e, em seguida, realizamos a PCR para avaliar o desempenho em comparação com os métodos padrão-ouro.

Então é nesse estágio que estamos agora. Se esses experimentos derem certo, acredito que, nos próximos, digamos, quatro a seis anos, talvez estejamos em uma situação em que tenhamos um chip integrado e um ensaio completo para influenza A, e também estamos trabalhando com clostridium difficile e amostras de fezes. E estamos, estamos, estamos também muito próximos de ter não apenas o dispositivo integrado, mas também o ensaio integrado.

Portanto, o desenvolvimento do ensaio e o design do chip precisam ocorrer em conjunto. Assim, para uma aplicação específica, voltada ao uso à beira do leito, trata-se realmente de um processo orientado a alvos. É necessário conhecer a amostra com a qual se está iniciando e o microrganismo que se está procurando, a fim de otimizar o chip para uso à beira do leito.

Então, acho que não estamos tão longe de tornar isso realidade de forma prototípica. Esses são nossos objetivos finais, então espero que consigamos alcançá-los.