Name: Cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a cultivar fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo em longo prazo para validação de terapias celulares em lesões medulares. Este método ex vivo melhora a sobrevivência e integração de células-tronco neurais transplantadas.

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O estudo foi apoiado pela Wings for Life Foundation (WFL-IT-20/21), o Plano Nacional de Recuperação e Resiliência da UE de Próxima Geração da União Europeia (NRRP) - missão 4 componente 2, investimento n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Ecossistema de Saúde da Toscana-THE, Spoke 8) e Marina Romoli Onlus. Este manuscrito reflete apenas os pontos de vista e opiniões dos autores, nem a União Europeia nem a Comissão Europeia podem ser considerados responsáveis por eles. Dados e metadados estão disponíveis em Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. As imagens foram geradas com Biorender https://www.biorender.com/.

Enxerto de longo prazo de células h-SC-NES em culturas organotípicas da medula espinhal

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Ainda não existe um tratamento eficaz para pacientes com LME. Diferentes abordagens têm sido testadas e uma das mais promissoras é baseada em uma estratégia regenerativa de reposição celular. Atualmente, os avanços no campo da medicina regenerativa exigem novas plataformas para testar a eficácia e a segurança dos transplantes de células, isoladamente ou em combinação com outras abordagens. Sua validação pré-clínica é essencial para a realização de novos estudos clínicos. As culturas organotípicas SC são uma plataforma útil para estudar diferentes aspectos da neurodegeneração, regeneração neural e neurodesenvolvimento, e para investigar a eficácia de novas abordagens terapêuticas23. Em particular, características específicas das culturas organotípicas, como a manutenção da histoarquitetura original e da composição celular e do microambiente, são vantajosas para desvendar a dinâmica do transplante, como enxerto celular, integração, diferenciação e maturação.
De acordo com os protocolos publicados, as fatias organotípicas SC podem ser mantidas em cultura por aproximadamente 2-3 semanas em condições saudáveis, o que limita seu uso para as investigações de longo prazo e triagem funcional necessárias para testar esquemas de terapia celular. Explorar processos importantes, como diferenciação e maturação para o destino correto das células transplantadas dentro do tecido SC, requer monitoramento de longo prazo. Esses processos celulares são críticos durante transplantes comuns em modelos animais. A disponibilidade de um sistema ex vivo que imita muitos recursos presentes in vivo seria útil na fase de triagem pré-clínica.
Por esse motivo, neste trabalho, propomos um método de cultura organotípica SC ideal de longo prazo (≥30 dias) que permite manter fatias SC viáveis por até 90 dias, triplicando seu tempo normal de cultura. Além disso, mostramos enxerto de células h-SC-NES estável dentro de fatias SC e a manutenção da cultura de transplante por até 30 dias. Monitoramos o enxerto celular ao longo do tempo, observando a expressão de GFP para verificar a sobrevivência celular até DPT 30. Após 30 DPT, avaliamos a taxa de apoptose celular. Na literatura, a avaliação da apoptose de células h-SC-NES transplantadas em fatias SC a 7 DPT tem sido relatada40. Aqui, estendemos a análise de apoptose celular no DPT 30 para comparar a taxa de apoptose em relação ao ponto de tempo anterior (DPT 7). Descobrimos que nossos dados estão de acordo com a literatura, sugerindo que as células h-SC-NES transplantadas sobrevivem também em um momento posterior se forem mantidas na condição de cultura otimizada em nosso trabalho. Esta plataforma ex vivo aprimorada de longo prazo sozinha e na configuração de transplante ajudará os pesquisadores na triagem pré-clínica para transplantes baseados em células-tronco para LME. Isso permitirá que eles identifiquem o melhor candidato celular para estudos in vivo que promovam o sucesso dos transplantes. Além disso, após a triagem inicial, as fatias organotípicas SC também podem ser usadas em paralelo aos estudos in vivo para confirmar e corroborar a dinâmica celular e os comportamentos de longo prazo observados em modelos animais ou para apoiar estudos mecanísticos.
Nosso protocolo descreve em detalhes como gerar esse modelo organotípico de longo prazo, mas algumas etapas críticas também devem ser discutidas. No que diz respeito à geração das culturas organotípicas de SC, existem alguns desafios durante a cirurgia e os primeiros estágios da cultura. Um procedimento cirúrgico bem realizado é essencial para gerar cortes que mantenham a histoarquitetura original. Se o SC for arruinado durante o isolamento, as fatias podem perder sua estrutura anatômica típica e o dano tecidual pode induzir um insulto pró-inflamatório excessivo, levando a condições insalubres e morte celular. A fase mais desafiadora durante a cirurgia é a extração do SC da espinha dorsal e a remoção das meninges do SC isolado. O sucesso dessas etapas depende da experiência do operador; portanto, recomenda-se um período de treinamento antes de iniciar os experimentos.
O seccionamento coronal do SC por meio de um helicóptero também é uma fase desafiadora. O SC isolado deve ser colocado na plataforma de corte exatamente perpendicular à lâmina. O operador também deve colocar a lâmina perpendicularmente à plataforma de corte. Esses cuidados são necessários para garantir a geração de fatias reprodutíveis entre os mesmos e diferentes experimentos. Outra questão importante é que o tempo para a cirurgia é limitado: todo o procedimento de geração de fatias deve levar ~ 30 min. Se o operador gastar mais tempo em cirurgia e corte, o tecido SC sofrerá e isso pode prejudicar o sucesso da cultura e as próximas etapas do experimento.
Uma vez que as fatias são colocadas na membrana de cultura, é importante alimentá-las corretamente. O GDNF é necessário para sustentar a recuperação e a sobrevivência do tecido. O corte com um picador é traumático para o tecido e, por esse motivo, as fatias são colocadas logo após o corte em um meio de dissecção gelado para limpar o excesso de moléculas pró-inflamatórias e promotoras de morte. Em seguida, as fatias são colocadas nas membranas de cultura (inserções de cultura de células) com meio fresco modificado com GDNF para promover uma recuperação mais rápida e adesão da fatia à membrana. O GDNF deve ser adicionado ao meio todos os dias durante a primeira semana na cultura devido à sua meia-vida curta50,51. Observamos que os cortes necessitam da presença contínua de GDNF durante os primeiros dias em cultura para promover a recuperação e viabilidade tecidual. Em qualquer caso, como a presença de GDNF é importante para todo o período de cultura, é fortemente desencorajado interromper a administração de GDNF em outros momentos.
Durante a primeira semana de cultura, também é importante verificar os cortes macroscopicamente a olho nu e ao microscópio. O tecido translúcido e a transparência das bordas são sinais de adesão adequada dos cortes à membrana e do tecido viável. O tecido necrótico parecerá extremamente branco à primeira vista macroscópica e as áreas necróticas aparecerão cinza escuro ao microscópio. Após algumas semanas em cultura, a morfologia do tecido pode mudar: os movimentos celulares e a adesão do tecido à membrana podem influenciar esse processo. Observamos, por exemplo, a perda da luz central em alguns cortes preenchidos por células e a perda da morfologia dorsal e ventral do corno. Isso acontece principalmente com fatias menores, enquanto a maioria delas manterá uma estrutura anatômica próxima à original. Os cortes geralmente são gerados a partir das regiões lombar ou torácica, pois desta forma podem ter o tamanho adequado para manter sua histoarquitetura original ao longo do tempo: se forem muito pequenos, perdem sua arquitetura enquanto, se muito grandes, a região central pode sofrer necrose. Assim, usamos a região lombar de filhotes de camundongos para gerar fatias com o tamanho apropriado para uma cultura ideal a longo prazo, mas, em princípio, outros segmentos podem ser considerados. Além disso, optou-se por utilizar a região lombar, pois as regiões ventral e dorsal são mais distinguíveis entre si. Além disso, essa região apresenta áreas teciduais com maior percentual de neurônios motores e substância cinzenta, que são locais de interesse para terapias de reposição celular na LME. Em relação ao transplante de células para as fatias, a principal questão está relacionada à quebra da ponta da microagulha de vidro. Se o orifício para a passagem das células for muito grande, pode causar danos ao tecido SC durante a microinjeção. Se for muito pequeno, o empilhamento de células pode obstruir a agulha, dificultando o processo de transplante. O procedimento de transplante deve ser concluído em 1 h para minimizar o sofrimento e a morte celular.
O protocolo proposto fornece uma ferramenta ideal e versátil para diferentes tipos de investigações. Aqui, aplicamos nossa plataforma de longo prazo para validar o transplante de células h-SC-NES nos primeiros estágios de diferenciação dentro do tecido SC de camundongo por 30 dias. A principal novidade da abordagem proposta é a otimização do protocolo de co-cultura. Os componentes do GM sustentam a sobrevivência neuronal a longo prazo das fatias SC e das células h-SC-NES transplantadas. De fato, o GM, sendo um meio livre de soro, sustenta a diferenciação das células transplantadas em direção ao destino neuronal em relação ao meio anteriormente usado para cultura de fatias organotípicas47.
Em relação aos modelos propostos para LME, os experimentos são geralmente realizados em camundongos adultos. Até o momento, as diferenças mais importantes entre as CT neonatais e adultas estão relacionadas ao maior potencial regenerativo encontrado no neonatoral em relação aos camundongos adultos52. No entanto, tais diferenças não têm impacto no tipo de protocolo que estamos propondo, uma vez que aqui nos concentramos na resposta das células enxertadas ao ambiente do tecido hospedeiro, e não nas capacidades de regeneração dos neurônios residentes. Outra diferença entre camundongos neonatais e adultos após uma LME está relacionada à formação da cicatriz glial que ocorre em adultos. Esse aspecto não é levado em consideração no modelo proposto, que não considera os complexos processos fisiopatológicos decorrentes de lesões primárias e secundárias.
Em relação às aplicações, a plataforma também poderá ser utilizada para investigar a integração entre as células transplantadas com circuitos residentes presentes no modelo organotípico SC. Ferramentas de engenharia genética já eram utilizadas no SNC para avaliar a conectividade sináptica e poderiam ser exploradas nesse sentido 53,54,55. Em particular, a integração pode ser investigada e validada avaliando a formação de sinapses entre as células enxertadas e o tecido SC ex vivo. Essas culturas organotípicas de longo prazo também podem ser exploradas para testar agentes neuroprotetores e neuroregenerativos ou novas moléculas/materiais ou para estudar distúrbios neurodegenerativos que envolvem o CS. Para estudar distúrbios neurodegenerativos específicos, o protocolo precisa ser adaptado para a cultura de fatias SC geradas a partir de modelos relevantes, como camundongos transgênicos portadores de mutações específicas associadas à patologia, no estágio relevante para a patologia (ou seja, neonatal, juvenil, adulto). Em conclusão, nosso protocolo e culturas organotípicas em geral, sendo explantes de um órgão específico, apresentam características que preenchem a lacuna entre culturas de células 2D e modelos in vivo, confirmando-os como uma ferramenta inestimável tanto para pesquisa básica quanto para testes pré-clínicos.

A lesão medular traumática (LM) tem consequências físicas, psicológicas e econômicas devastadoras para pacientes e cuidadores1. Muitas tentativas foram feitas para promover a regeneração axonal na LME com diferentes abordagens 2,3,4 e alguns efeitos benéficos foram demonstrados pela formação de relés neuronais entre neurônios proximais e distais no local da lesão por meio de terapias de substituição celular. O interesse em terapias celulares ainda está crescendo5, uma vez que as células transplantadas podem desempenhar muitos papéis, incluindo suporte trófico, modulação imunológica, regeneração de circuitos neurais perdidos por meio da indução de plasticidade, substituição celular e remielinização do axônio6.
Recentemente, o principal esforço no campo se concentrou em células-tronco neurais / progenitoras humanas (NSCs / NPCs) 7. Vários estudos sugerem que NSCs/NPCs modulam a resposta dos astrócitos8, promovem a secreção de fatores pró-regenerativos 9,10 e substituem células neuronais ausentes na LME11,12. No entanto, estudos que apoiam a diferenciação de células transplantadas em neurônios funcionais ainda são pobres. Além disso, a sobrevivência e diferenciação das células transplantadas na medula espinhal lesada (SC) são baixas13, possivelmente porque as células transplantadas levam várias semanas, até meses, para se diferenciar in vivo. Além disso, os estudos atuais não elucidaram completamente muitos aspectos bioquímicos, moleculares, celulares e funcionais das terapias de reposição celular. Nesse contexto, modelos simples, rápidos e econômicos são necessários para estudar os mecanismos de enxerto celular, a capacidade das células enxertadas de proliferar, diferenciar-se em tipos específicos ou subpopulações de células e formar sinapses com neurônios residentes.
A integração de estudos histológicos no registro eletrofisiológico e no perfil do transcriptoma e do proteoma é necessária para uma compreensão completa da cascata molecular que ocorre após o transplante de células. Isso certamente acelerará o projeto e a validação de novas terapias de reposição celular em modelos pré-clínicos e estudos clínicos. De fato, até o momento, o uso de roedores, animais de grande porte e primatas não humanos tem valido a pena para elucidar muitos processos celulares após o transplante14. No entanto, devido ao alto custo, ao alto impacto ético, bem como à complexidade do organismo, seu uso muitas vezes não é simples ou inadequado para desvendar processos bioquímicos e moleculares. Além disso, podem apresentar muitas desvantagens correlacionadas com diferenças biológicas, tanto interespécies (metabolismo) quanto variabilidade intraespécies (sexo, idade).  Esses fatores, juntamente com fatores externos, como situações estressantes, podem alterar o resultado de um experimento e sua previsibilidade em termos de tradução terapêutica para humanos 15,16,17.
Assim, muitos grupos empregam cultura de células in vitro 2D e fatias organotípicas ex vivo (culturas ex vivo), além de modelos animais. A cultura de células 2D é o sistema mais comumente usado para estudar processos biológicos específicos em um nível de célula única e/ou população de células. No entanto, as culturas de células de monocamada não refletem a complexidade encontrada em um organismo inteiro. A falta de estruturas teciduais e ambiente fisiológico não permite que os sistemas de cultura 2D emulem completamente os principais aspectos estruturais, morfológicos e funcionais do tecido investigado 18,19,20.As culturas organotípicas podem superar alguns desses problemas. Os modelos organotípicos baseiam-se no explante de um fragmento de um tecido ou órgão e na sua manutenção ex vivo por um período limitado21,22. Em particular, fatias do tecido explantado são geradas com uma espessura precisa que permite que os nutrientes cheguem facilmente a quase todas as células das fatias. Podem ser gerados a partir de várias regiões do sistema nervoso central, como hipocampo, hipotálamo, cerebelo, tálamo, córtex cerebral, substância negra e estriado e medula espinhal23. As culturas organotípicas retêm a arquitetura do tecido, a distribuição espacial das células, a diversidade celular e o ambiente (ou seja, composição da matriz extracelular) do órgão de origem. Além disso, eles preservam a atividade neural original, as conexões entre as células e, em particular, os circuitos de curta distância após o explante.
Esses aspectos fornecem algumas vantagens para culturas ex vivo em relação a culturas de monocamada e modelos animais. Eles mantêm as principais características teciduais encontradas in vivo, mas com a redução dos custos e a possibilidade de realizar diferentes tipos de experimentos moleculares, celulares e funcionais com uma regulação precisa dos parâmetros ambientais da cultura 24,25,26,27,28,29. Fatias organotípicas também podem ser exploradas para desenvolver modelos para diferentes distúrbios neurológicos, assemelhando-se às principais características histopatológicas de condições específicas30. Além disso, a retenção do ambiente original do tecido multicelular os torna plataformas apropriadas para triagem de drogas e para testar moléculas e materiais neuroprotetores e neuro-regenerativos.
Neste trabalho, propomos o uso de culturas organotípicas SC como modelo para otimizar transplantes de NSC. Isso não é trivial, pois são necessárias condições ideais de cultura para garantir a sobrevivência do hospedeiro (tecido SC) e do transplante (NSCs) por semanas. Diferentes grupos de pesquisa enxertados em culturas organotípicas, derivadas do cérebro e derivadas de SC, vários tipos de células. A maioria dos trabalhos mostrou o transplante de células-tronco mesenquimais 31,32,33, células de revestimento olfativo 34 ou NSCs 35,36,37,38,39,40 e avaliou as interações das células enxertadas com as células hospedeiras, a sobrevivência de todo o sistema e se as células transplantadas se diferenciaram em neurônios ou células semelhantes a neurônios dentro do ambiente tecidual ex vivo 32,33,41. Alguns deles avaliaram o potencial regenerativo das células após o transplante, observando seu crescimento axonal dentro do tecido 37,40,41, a capacidade mielinizante de precursores enxertados de oligodendrócitos 42, a migração de células enxertadas para o tecido hospedeiro43 e se as células transplantadas liberaram fatores que impulsionam um ambiente pró-regenerativo31. Uma limitação dos estudos atuais é que eles não exploram o enxerto por um período de longo prazo.
Considerando que os NSCs parecem exigir várias semanas para se diferenciar in vivo44,45, este estudo se concentra em como gerar e manter fatias de SC de camundongo de longo prazo (≥30 dias) por até 90 dias. Verificou-se que as fatias mantêm sua estrutura anatômica original e mantêm uma taxa apoptótica baixa e estável ao longo do tempo e alta viabilidade celular. Observamos expressão difusa dos marcadores neuronais RNA binding fox-1 homólogo 3 (RBFOX3) e cadeia leve de neurofilamento (NFL), com este último mostrando uma tendência crescente de brotamento axonal ao redor das fatias ao longo do tempo, atestando sua condição saudável. Além disso, transplantamos com sucesso para as fatias SC células-tronco neuroepiteliais derivadas de SC humanas que expressam GFP (h-SC-NES) nos primeiros estágios da diferenciação neuronal. O enxerto NSC foi mantido por 30 dias após o transplante e as células apresentaram expressão de GFP durante todo o período em cultura. A taxa apoptótica de células no dia pós-transplante (DPT) 30 também foi encontrada em linha com o valor da taxa apoptótica observada no DPT 7 nas mesmas células40. As células pareciam enxertar no ambiente do tecido e sobreviveram por várias semanas.
Em resumo, nossos dados demonstram que é possível manter em cultura cortes organotípicos SC por 3 meses sem comprometer sua citoarquitetura original e o ambiente tecidual. Mais importante ainda, eles podem ser explorados para testar terapias celulares antes de prosseguir com um experimento in vivo , reduzindo assim os custos e o tempo experimental. Aqui, ilustramos em detalhes todas as passagens para gerar fatias organotípicas SC de camundongos e como mantê-las por períodos de longo prazo (≥30 dias). Além disso, explicamos profundamente como realizar o transplante de NPC nas fatias e como mantê-las para análise a jusante.

<table><tbody><tr><td>Caspase anti-clivada-3,&nbsp; (Asp175) (5A1E) (Coelho)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - policlonal</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL (Mouse)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td><td>Biologend</td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Leica</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células classificada água</td><td>Sigma / Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno da cauda de rato</td><td>Sigma / Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal - Microscópio Confocal A1 (Eclipse Ti)</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glicose</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>que disseca os</td><td>instrumentos</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro, 3.5"&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra-anti Coelho IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra-anti Coelho IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Graph Pad-Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>Software para Análise Estatística</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Cavalo Soro</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Preparação Lentiviral</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MORTO Kit de ensaio de viabilidade/citotoxicidade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de microcarregador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>para carregar células na agulha para transplante</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de cultura de células Millicell</td><td>Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura miscroscope</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri (35 mm)</td> <td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma / Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de pasteur de plástico</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor pneumático</td> dos instrumentos <td>PV830</td> da <td>precisão do mundo</td> de PicoPump <td>para a lâmina</td></tr> do bisturi <tr><td>da poli-L-lisina</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>do transplante da lâmina No 10 do bisturi de aço inoxidável estéril</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>#3</td><td>Mola dos instrumentos da precisão do mundo</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td> Instrumentos</td> de <td>Precisão Mundial</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio para imagem e aquisição</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio para cirurgia</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Pinças-Dumont #5-inox</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vannas, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta vertical</td><td>Shutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R & D Sistemas</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Faltam curas resolutivas para as lesões medulares (LMEs), devido à complexa fisiopatologia. Uma das abordagens regenerativas mais promissoras é baseada no transplante de células-tronco para repor o tecido perdido e promover a recuperação funcional. Esta abordagem deve ser melhor explorada in vitro e ex vivo para segurança e eficácia antes de prosseguir com testes em animais mais caros e demorados. Neste trabalho, mostramos o estabelecimento de uma plataforma de longo prazo baseada em fatias organotípicas da medula espinhal (SC) de camundongos transplantadas com células-tronco neurais humanas para testar terapias de substituição celular para LMEs.
As culturas organotípicas SC padrão são mantidas por cerca de 2 ou 3 semanas in vitro. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para manutenção de longo prazo (≥30 dias) por até 90 dias. O meio usado para cultura de longo prazo de fatias SC também foi otimizado para transplante de células-tronco neurais para o modelo organotípico. As células-tronco neuroepiteliais derivadas de SC humano (h-SC-NES) carregando um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) foram transplantadas em fatias de SC de camundongo. Trinta dias após o transplante, as células ainda apresentam expressão de GFP e baixa taxa apoptótica, sugerindo que o ambiente otimizado sustentou sua sobrevivência e integração dentro do tecido. Este protocolo representa uma referência robusta para testar eficientemente terapias de reposição celular no tecido SC. Esta plataforma permitirá aos investigadores realizar uma pré-triagem ex vivo de diferentes terapias de transplante celular, ajudando-os a escolher a estratégia mais adequada antes de prosseguirem com as experiências in vivo .

Os métodos descritos permitem o estabelecimento de fatias organotípicas de SC de camundongos no estágio P3 e sua manutenção em cultura por um tempo prolongado em condições saudáveis. Além disso, mostramos um protocolo para transplantar células para as fatias e co-cultivá-las por até 30 dias (Figura 1). Primeiro, mostramos a otimização das condições de cultura e um protocolo adequado para cultura prolongada das fatias SC com células transplantadas (Figura 2A). As fatias são geradas e mantidas do DEV 0 até o DEV 2 na MO, que foi originalmente proposta como um meio ótimo para a manutenção das fatias SC47. No entanto, devido à presença de proteínas séricas, esse meio pode ser subótimo para sustentar a diferenciação neuronal e a maturação das células precursoras neurais transplantadas. De fato, no DEV 3, testamos a mudança de OM para GM, uma formulação contendo Neurobasal mais B27, que suporta a sobrevivência neural, e sem soro, que inibe a diferenciação neuronal correta, promovendo um destino glial48,49.
A Figura 2B mostra os resultados alcançados com a troca do meio no DEV 3 de OM para GM, em comparação com as fatias SC que não receberam a troca (as fatias de controle foram cultivadas em OM). Usamos a distribuição do sinal NFL dentro dos cortes como um marcador de integridade neuronal (Figura 2B,C). As fatias no DEV 7 foram saudáveis em ambas as condições de cultivo, mostrando a distribuição difusa de neurofilamento (NFL, em verde) dentro delas. No DEV 10, as fatias cultivadas em GM pareciam ser mais saudáveis em relação às fatias de controle cultivadas em MO, conforme documentado pela distribuição de coloração da NFL. Também estimamos a área NFL+ (% NFL+ Area/DAPI+ Area) dos cortes mostrados nas imagens representativas da Figura 2B. A área estimada da NFL+ é representada nos histogramas da Figura 2C, confirmando que o sinal da NFL é distribuído difusamente nas fatias no DEV 7 em ambas as condições. No entanto, no DEV 10, a área estimada coberta pela coloração NFL diminui para a condição de cultura OM.
Esses dados sugerem que a mudança para o GM no DEV 3 é bem tolerada para cultura prolongada de fatias SC (DEV 10). Como próximo passo, testamos o GM em pontos de tempo mais prolongados: DEV 30, DEV 60 e DEV 90. Conforme mostrado na Figura 3A,B, as fatias foram mantidas saudáveis em cultura até o DEV 90. A coloração NFL foi amplamente presente nas fatias em cada ponto de tempo, com brotos difusos ao redor das fatias de neuritos que partem da região central. De fato, estimamos a área NFL+ das fatias mostradas na Figura 3A e ela aumentou ao longo do tempo, conforme mostrado nos histogramas da Figura 3B. Também observamos positividade para o marcador neuronal RBFOX3, fornecendo outra linha de evidência da diferenciação neuronal das fatias. Em cada momento, também verificamos a taxa de apoptose avaliando em diferentes fatias o número de células positivas para aCASP3 (Figura 4A,B). A análise foi realizada conforme descrito na seção 10.2 do protocolo. A taxa apoptótica (% de células aCASP3+/número total de células DAPI+) foi muito baixa em cada ponto de tempo (0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27%, 0,66 ± 0,45% para DEV 30, 60 e 90, respectivamente) sem diferenças significativas entre os três pontos de tempo considerados (valor de p &gt; 0,05, Figura 4B). Esses dados sugerem que a taxa apoptótica associada ao aCASP3 permanece estável ao longo do tempo e, juntamente com a ampla distribuição da NFL nos cortes (Figura 4A), confirmam a sobrevivência dos cortes em cada momento.
Em apoio aos dados anteriores, também realizamos um ensaio vivo/morto para avaliar a viabilidade das fatias nos três momentos diferentes. Usamos Calceína (coloração verde) para marcar as células viáveis e metabolicamente ativas e Sytox (coloração ciano) para avaliar a morte celular. Conforme mostrado nos histogramas da Figura 4C, a porcentagem de células metabolicamente ativas aumenta ligeiramente de DEV 30 para DEV 90 (93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02%, 96,33 ± 3,10% para DEV 30, 60 e 90, respectivamente), estabilizando-se entre os dois últimos pontos de tempo (DEV 30 vs DEV 60 valor de p = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 valor de p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 valor de p = 0,99). Encontramos baixos níveis de morte celular que diminuíram ao longo do tempo (6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02%, 3,66 ± 3,10% para DEV 30, 60 e 90, respectivamente) e uma diferença significativa foi encontrada entre DEV 30 e pontos de tempo posteriores, DEV 60 e DEV 90 (DEV 30 vs DEV 60 valor de p = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 valor de p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 valor de p = 0,99). Esses dados, em associação com a taxa de apoptose, confirmam a sobrevida do corte ao longo do tempo e apoiam a eficácia do protocolo de cultura de longo prazo realizado.
Uma vez estabelecida a viabilidade da cultura prolongada das fatias de SC, desafiamos o sistema pelo transplante de células h-SC-NES nos primeiros estágios da diferenciação neuronal. Testamos as células h-SC-NES porque elas mostraram resultados promissores para o tratamento da LME12. O procedimento de transplante de células h-SC-NES nas fatias SC de camundongo é descrito na seção 6 do protocolo. As fatias SC e as células h-SC-NES transplantadas foram mantidas até o DPT 30. As células foram enxertadas no DIV 10 de diferenciação (estágio precursor neural) em fatias organotípicas de DEV 4, conforme mostrado no esquema de protocolo da Figura 5A. As células transplantadas foram monitoradas quanto à expressão de GFP em cultura por até 30 dias. A Figura 5B mostra imagens ao vivo representativas, em diferentes DPT, de uma fatia SC com células GFP+ transplantadas. A expressão estável de GFP ao longo do tempo (Figura 5B e Figura 6A) sugere que as células sobreviveram no tecido SC nas condições de cultura previamente otimizadas. Também verificamos a taxa apoptótica de células transplantadas, conforme descrito na seção 10.2 do protocolo. A taxa apoptótica (% de células aCASP3+ /número total de células Hu-Nu+ ) foi muito baixa (0,44 ± 0,34%) após 30 DPT (Figura 6B). Além disso, a taxa apoptótica no DPT 30 estava alinhada com a encontrada para o mesmo tipo de células no DPT 7, conforme relatado anteriormente40, documentando que as culturas se estabilizam com o tempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo. Esquema representativo mostrando o fluxo de trabalho geral do protocolo realizado. (A) À esquerda, um esquema resumindo a geração de fatias SC de camundongos a partir de SC isolado de filhotes de camundongos em P3 e cultura de longo prazo de fatias organotípicas SC. (B) À direita, um esquema resumindo o transplante de células h-SC-NES que expressam GFP em fatias organotípicas SC de camundongo. As células enxertadas são mantidas por 30 dias após o transplante. Abreviaturas: h-SC-NES = tronco neuroepitelial derivado da medula espinhal humana; GFP = proteína fluorescente verde; DEV = dia ex vivo; DPT = dia pós-transplante; NFL = cadeia leve de neurofilamento; RBFOX3= Homólogo fox-1 de ligação ao RNA 3; aCASP3 = Caspase-3 ativa; SC= medula espinhal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Figura 2: Otimização das condições de cultura a longo prazo. (A) Esquema representativo do protocolo para teste de MO e GM. A MO é mantida até DEV 7-10 para o grupo controle. O meio é comutado para o GM no DEV 3 para as fatias tratadas; em seguida, eles são fixados no DEV 7-10 para comparação com os controles. (B) Imagens representativas comparando fatias organotípicas de SC de camundongos em DEV 7 e 10 cultivadas em diferentes condições. As fatias são coradas para o neurofilamento marcador do citoesqueleto (NFL, verde). A ampla distribuição da coloração NFL em fatias cultivadas com GM sugere uma sobrevida e diferenciação global. Os núcleos são contracorados com DAPI. Barra de escala = 500 μm. (C) Histogramas representativos da estimativa da área coberta pela NFL nas fatias mostradas na Figura 1B. No DEV 10, a área de superfície da NFL diminui na condição de cultura OM. Abreviaturas: DEV = dia ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadeia leve de neurofilamento.; MO = meio organotípico; GM = meio de enxerto; SC = medula espinhal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Figura 3: Fatias organotípicas SC de camundongos cultivadas a longo prazo. (A) As fatias são mantidas em cultura até DEV 90. O ensaio de imunofluorescência revela uma ampla distribuição do marcador neurofilamento do citoesqueleto (NFL, verde) e do marcador neuronal nuclear RBFOX3 (vermelho), atestando sua condição saudável e identidade neuronal após cultura de longo prazo. É importante notar que os axônios NFL+ brotam difusamente ao redor das fatias ao longo do tempo. Os núcleos são contracorados com DAPI. Barra de escala = 500 μm. (B) Histogramas representativos da estimativa da área e tempo NFL+ e da área RBFOX3+ das fatias mostradas no painel A. A área de neuritos da NFL+ aumenta com o tempo. Abreviaturas: DEV = dia ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadeia leve de neurofilamento; SC = medula espinhal; RBFOX3= Homólogo fox-1 de ligação ao RNA 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Figura 4: Avaliação da viabilidade celular nas fatias SC ao longo do tempo. (A) Imagens representativas de fatias organotípicas em DEV 60 coradas para aCASP3 (vermelho) e NFL (verde). Barra de escala = 100 μm. NFL mostra um padrão difuso. Células raras são positivas para o marcador apoptótico aCASP3 (Inserções: 1-2-3). (B) Análise da taxa de apoptose em fatias em diferentes momentos. Média ± DP, N (repetições) = 6 fatias, n (células totais) &gt; 1.000 para cada fatia, teste de Kruskal-Wallis, comparação múltipla, valor de p &gt; 0,05. A taxa apoptótica é estável ao longo do tempo. Nas inserções 1-2-3 do painel A, é possível observar detalhes de células positivas para aCASP3 (coloração vermelha, setas brancas). Pequenos pontos vermelhos rotulam detritos celulares e núcleos picnóticos. Barra de escala = 50 μm. (C) Imagens representativas do ensaio vivo/morto realizado em fatias SC no DEV 90: as células metabolicamente ativas são marcadas em verde com calceína, enquanto as células mortas e danificadas são marcadas em azul claro (ciano) com Sytox. Os dois histogramas mostram a % de células positivas para Calceína (à esquerda) e Sytox (à direita) no número total de células. Para ambos os ± médios, N (repetições) = 6 fatias, n (células totais) &gt; 1.000 para cada fatia, teste de Kruskal-Wallis, comparação múltipla, DEV 30 vs DEV 60 valor de p = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 valor de p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 valor de p &gt; 0,99. Abreviaturas: DEV = dia ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadeia leve de neurofilamento; SC = medula espinhal; aCASP3 = caspase-3 ativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Figura 5: Transplante de células h-SC-NES em fatias organotípicas de camundongos. (A) Esquema representativo do protocolo de transplante. As células são transplantadas como precursores neurais no DIV 10 de diferenciação em fatias organotípicas DEV 4. (B) Imagens representativas de fatias organotípicas de camundongos transplantadas com células h-SC-NES que expressam GFP ao longo do tempo até DPT 30. As células são transduzidas com um vetor lentiviral que carrega o gene GFP . A expressão de GFP ao longo do tempo confirma sua viabilidade e adaptação ao ambiente de fatia. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: DIV = primeiro dia na pré-diferenciação; h-SC-NES = tronco neuroepitelial derivado da medula espinhal humana; GFP = proteína fluorescente verde; DEV = dia ex vivo; MO = meio organotípico; GM = meio de enxerto; DPT = dias pós-transplante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Figura 6: Avaliação da taxa de apoptose de células h-SC-NES transplantadas após 30 dias do transplante. (A) Imagem representativa de uma fatia organotípica de camundongo transplantada com células h-SC-NES que expressam GFP. As células são transduzidas com um vetor lentiviral que carrega o gene GFP para monitorá-las nas fatias após o transplante. A expressão de GFP ao longo do tempo confirma sua viabilidade e adaptação ao ambiente de fatia. O ponto de tempo mostrado é DPT 30; as células são coradas para núcleos humanos (ciano) e aCASP3 (vermelho). Barra de escala = 150 μm. (B) À esquerda, gráfico de pizza representativo da análise de apoptose de células transplantadas em fatias em DPT 30 (N (réplicas) = 5 fatias, n (células) = 5.000) e, à direita, uma inserção de células Hu-Nu+ e um detalhe de uma célula positiva para aCASP3 (seta branca). Barra de escala = 75 μm. Pequenos pontos vermelhos rotulam detritos celulares e núcleos picnóticos. Abreviaturas: h-SC-NES = tronco neuroepitelial derivado da medula espinhal humana; GFP = proteína fluorescente verde; DPT = dia pós-transplante; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadeia leve de neurofilamento; aCASP3 = caspase-3 ativa; Hu-Nu = núcleos humanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Composição das soluções utilizadas neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Neste artigo, fornecemos um método reprodutível para gerar e manter fatias organotípicas da medula espinhal de longo prazo transplantadas com células-tronco neurais como um modelo ex vivo para testar terapias de reposição celular.

Cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular

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Cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular (Vídeo) | JoVE Journal

Cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular

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