Perfil de O-glicanos de mucina permetilada usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz

Estamos estudando a glicobiologia das interações entre microrganismos hospedeiros e microrganismos no trato gastrointestinal, com foco no papel da camada de muco que cobre o trato gastrointestinal, e, em particular, mucinas e seus glicanos na saúde e doença. Os mucin-glicanos são cada vez mais reconhecidos como fatores importantes nas interações hospedeiro-microrganismo, pois fornecem nutrientes e locais de ligação para as bactérias. Uma alteração no perfil de glicosilação pode levar a distúrbios na composição microbiótica e, vice-versa, fenótipos comumente observados em estados de doença.

No entanto, as mucinas são notoriamente difíceis de estudar, pois são fortemente glicosiladas. Inovações em técnicas de amostragem e análises bioinformáticas subsequentes podem impulsionar o campo, assim como novas abordagens de processamento de amostras para aumentar o débito e reduzir o tempo desde a coleta até os resultados. Outras técnicas analíticas permitem caracterizações estruturais mais detalhadas dos glicanos, mas exigem longa duração e tempo de análise.

A técnica descrita aqui usando espectrometria de massa MALDI-TOF tem vantagem de velocidade, o que a torna de alta taxa e adequada para triagem e perfilamento. Para começar, misture mucinas purificadas com 250 microlitros do tampão de eliminação beta em um frasco de vidro de quatro mililitros. Fele o frasco firmemente com uma tampa revestida de politetrafluoroetileno e incube a reação a 45 graus Celsius por 16 horas.

No gelo, adicione um mililitro da solução de ácido acético 5% à mistura de reação de forma progressiva em gota. Para dessalinizar a amostra, tape uma pipeta de vidro com uma pequena quantidade de lã de vidro. Adicione 1,5 mililitro da suspensão de resina à pipeta de vidro por cima, depois deixe que ela se assente e drene.

Agora, lave a resina com dois mililitros de ácido acético a 5% e descarte o fluxo de água. Depois, adicione a amostra de mucina à coluna de dessalinização e colete o fluxo em um tubo de cinco mililitros. Lave a coluna duas vezes com um mililitro de ácido 5%acético para coletar o fluxo.

Depois, usando um evaporador centrífugo, remova o ácido acético e concentre a amostra a cinco milibares e 30 graus Celsius por duas horas. Dissolva a amostra em 0,5 mililitros de ácido acético metanolo e sece-a sob um jato de nitrogênio. Usando uma seringa de vidro, adicione quatro mililitros de DMSO ao frasco contendo hidróxido de sódio e mistura de metanol.

Após o vórtice, centrifuge a solução a 2.000 G por dois minutos. Decante cuidadosamente o sobrenadante e remova os sais sem mexer no gel. Após garantir que não haja mais sais, ressuspenda o gel em quatro mililitros de DMSO anidro para preparar a suspensão da base de permetilação.

Em seguida, na amostra de mucina seca, adicione DMSO anidro e base de permetilação, imediatamente seguidos pelo iodometano. Incube a reação de permetilação por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação vigorosa. Depois, adicione 0,5 mililitros de água para interromper a reação.

Depois que a amostra ficar turva, lave-a com nitrogênio até que fique transparente. Carregue a amostra em uma placa de extração de balanço lipofílico hidrofílico com 96 poços. Aplique pressão positiva para empurrar as amostras através da fase sólida a uma vazão de aproximadamente um mililitro por minuto.

Após descartar o flowthrough, lave os poços duas vezes com um mililitro de água. Elua os glicanos da placa duas vezes com um mililitro de metanol. Aplique pressão apenas até que o metanol comece a sair da placa, então permita o fluxo gravitacional para manter a taxa exigida.

Seque a amostra usando um evaporador centrífugo e dissolva-a em 10 microlitros de TA50. Após misturar um microlitro de amostra com a matriz, carregue-a sobre uma placa de aço alvo MALDI e deixe secar. Para análise de dados, carregue o arquivo ASCII exportado do espectro de massa no GlycoWorkbench.

Após realizar a correção de linha de base, calcule os centróides de pico e, na janela pop-up, selecione a faixa de massa apropriada, a relação mínima sinal-ruído e a intensidade máxima mínima da espectrometria de massa. Depois, use a ferramenta Glyco-Peakfinder para identificar as composições estruturais que correspondem à lista de picos. Escolha perMe como derivitização, redEnd como extremidade redutora e defina o número mínimo e máximo de resíduos esperados.

Para mucinas, selecione Hexose, N-Acetil-Hexosamina, Deoxi-Hexosa e N-Acetilneuramínico. Para glicanos sulfatados, use a opção de Outro resíduo com massa de 87,9. Para dados MALDI-TOF, defina o número máximo de íons de sódio e cargas para um cada, e ajuste a precisão para 0,5 Daltons.

Selecione todas as anotações corretas com a tecla Control e clique em cada uma delas. Clique com o botão direito nas anotações selecionadas e escolha Adicionar à lista de picos anotados. Para gerar um relatório comparando múltiplos espectros anotados, vá em Ferramentas seguidas por Relatórios e crie um relatório comparando diferentes perfis.

Imprima o relatório em PDF para salvá-lo. Para análise de espectros de fragmentação, carregue os espectros no GlycoWorkbench e gere a lista de picos como demonstrado anteriormente. Desenhe estruturas de glicanos supostos que correspondam às composições de glicanos anotados.

Para gerar fragmentos para cada estrutura, clique com o botão direito para selecionar Copiar fragmentos para a tela e escolha Calcular fragmentos na ferramenta Fragmentos. Para análise adicional de fragmentação, clique em um pico de interesse no visualizador de espectro. Clique com o botão direito e selecione Encontrar todas as estruturas que correspondam aos picos para consultar a razão de carga mestra do pico selecionado em relação a bancos de dados online.

Selecione estruturas supostas de interesse e clique com o botão direito para copiá-las na janela de tela com a opção apropriada. Para calcular possíveis fragmentos de cada estrutura glicana, selecione a estrutura na tela. Depois, em ferramentas e fragmentos, selecione fragmentos de cálculo para a estrutura atual.

Se fragmentos para mais de uma estrutura glicana foram calculados, acesse a visualização de tabela Fragmentos na aba Resumo para visualizar a tabela de comparação. Selecione os fragmentos que correspondem à lista de picos para cada estrutura potencial de glicano. Clique com o botão direito e escolha Copiar fragmentos para a tela no menu suspenso.

Por fim, na aba Ferramentas, vá para Profiler seguido de Anotar picos com todas as estruturas. Depois, selecione Ferramentas, Relatórios e Crie um relatório com as anotações. A dessalinização por troca iônica resultou em melhor recuperação de glicanos maiores, com essas estruturas maiores representando 31% do total de glicanos, em comparação com 21% para a extração de PGC.

Entre as estruturas de glicanos identificadas, um glicano foi identificado apenas através da amostra dessalinizada por troca iônica. Além disso, o dessalinização por troca iônica e remoção de borato levou a espectros com maiores relações sinal-ruído em comparação com aqueles produzidos após a dessalinização por extração em fase sólida com PGC. Tempos de reação de permetilação de 30 e 90 minutos levaram à identificação de 33 picos de glicano, enquanto uma reação de cinco minutos identificou apenas 31 picos.