Detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease FEN1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas

Desenvolvemos um método baseado em fluorescência para detectar as atividades da nuclease FEN1 e rastrear os inibidores de moléculas pequenas, avançando no diagnóstico e na pesquisa terapêutica direcionada.

Os desafios atuais de expressão incluem a complexidade e as preocupações de segurança dos métodos convencionais, juntamente com o alto custo e o equipamento especializado necessário para as técnicas existentes baseadas em fluorescência.

Este protocolo abordou a deficiência do método radiológico tradicional e as técnicas de fluorescência de alto custo, fornecendo uma solução de detecção mais segura, eficiente e fácil de usar.

Nosso laboratório se concentrará na otimização de uma plataforma de triagem de alto rendimento para explorar aplicações e mecanismos in vivo de inibidores de FEN1 na terapia do câncer.

[Instrutor] Para começar, projete fitas de oligonucleotídeos de DNA com base na atividade de clivagem específica do FEN1. Misture os oligonucleotídeos de DNA de fita simples em um tampão de recozimento. Adicione 10 microlitros de tampão de recozimento e água deionizada para fazer um volume total de 50 microlitros. Em seguida, aqueça a mistura de reação a 100 graus Celsius por um minuto em um banho de metal. Transfira imediatamente o tubo para 72 graus Celsius e incube por 10 minutos. Em seguida, desligue a fonte de calor e deixe a solução esfriar gradualmente até a temperatura ambiente para formar o substrato completo de DNA de fita dupla. Para o ensaio de atividade da nuclease FEN1, primeiro combine dois microlitros do substrato de DNA com a nuclease FEN1 no tampão de reação. Incube a mistura de reação em um banho de metal a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione 20 microlitros de tampão de terminação 2X para interromper a reação. Em seguida, carregue 20 microlitros da amostra terminada em um gel de poliacrilamida desnaturante a 12% pré-preparado. Eletroforese o gel a 100 volts por 60 minutos. Depois de concluído, visualize os resultados da eletroforese em um sistema de imagem de fluorescência. Com uma pipeta, transfira dois microlitros de dimetilsulfóxido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione dois microlitros de nuclease FEN1 e 10 microlitros de tampão de reação 2X ao tubo e seis microlitros de água deionizada. Misture bem a solução e incube-a no gelo por 10 minutos. Após a incubação, pipetar dois microlitros de substrato de DNA para atingir um volume de reação final de 20 microlitros. Em seguida, prepare uma diluição de trabalho do inibidor de nuclease FEN1 FEN1-IN-4 realizando uma diluição serial dupla de uma solução estoque de um molar em dimetilsulfóxido. Pipete dois microlitros de nuclease FEN1 e o inibidor FEN1-IN-4 diluído em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, pipete 10 microlitros de tampão de reação 2X e quatro microlitros de água deionizada. Misture delicadamente e incube a mistura no gelo por 10 minutos. Agora, adicione dois microlitros de substrato de DNA ao tubo para fazer o volume final de 20 microlitros. Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius em um banho de metal por 15 minutos. Em seguida, termine a reação adicionando 20 microlitros de tampão de terminação. Uma banda de proteína clara em aproximadamente 45 kilodaltons confirmou a purificação bem-sucedida da nuclease FEN1 da expressão induzida. O substrato de DNA de fita dupla marcado com fluoresceína apareceu a 80 kilodaltons, confirmando a síntese bem-sucedida em comparação com o substrato de fita simples a 59 kilodaltons. A nuclease FEN1 clivou o substrato de DNA de fita dupla de 80 nucleotídeos de maneira dose-dependente, com clivagem completa observada em 0,5 microgramas por microlitro. O composto FEN1-IN-4 inibiu significativamente a clivagem do substrato de DNA de fita dupla pelo FEN1, conforme mostrado pela retenção da banda de 80 nucleotídeos. FEN1-IN-4 reduziu a atividade da nuclease FEN1 de maneira dependente da concentração, com uma concentração inibitória máxima de 14,03 micromolar.