Name: Detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease FEN1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Aprenda a detectar a atividade da nuclease FEN1 por fluorescência e triar inibidores de moléculas pequenas. Este ensaio bioquímico oferece uma solução segura e eficiente para pesquisas em terapia contra câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell-virus-virophage+tripartite+infection+systems+discovered+in+the+freshwater+lake+Dishui+Lake+in+Shanghai%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China.</a> J Virol. 94 (11), e00149(2020).</li>
<li>Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virophages+of+giant+viruses%3A+An+update+at+eleven%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Virophages of giant viruses: An update at eleven.</a> Viruses. 11 (8), 733(2019).</li>
<li>Paez-Espino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+evolution%2C+and+classification+of+virophages+uncovered+through+global+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics.</a> Microbiome. 7 (1), 157(2019).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+FEN1+nuclease+and+its+link+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer.</a> Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).</li>
<li>Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+targeting+FEN1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy.</a> Biomolecules. 12 (7), 946(2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FEN1+promotes+DNA+damage+and+enhances+chemotherapeutic+response+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells.</a> Med Oncol. 40 (8), 242(2023).</li>
<li>Abdel-Fatah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+protein+expression+analysis+reveals+flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+key+biomarker+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer.</a> Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).</li>
<li>Guo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+endonuclease+as+a+therapeutic+target+for+human+cancers+with+defects+in+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).</li>
<li>Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+novel+diagnostic+and+prognostic+biomarker+for+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Res+Hepatol+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer.</a> Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).</li>
<li>Finger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-flap+pocket+of+human+flap+endonuclease+1+is+critical+for+substrate+binding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis.</a> J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).</li>
<li>Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-protein+interaction+modes+of+FEN-1+with+gap+substrates+and+their+implication+in+preventing+duplication+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations.</a> Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).</li>
<li>McWhirter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+fluorescence+polarization+DNA+cleavage+assay+for+the+identification+of+FEN1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors.</a> J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).</li>
<li>Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+non-radioactive+assays+for+investigation+of+human+flap+endonuclease+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).</li>
<li>Van Pel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+synthetic+lethal+interaction+network+identifies+FEN1+as+a+broad-spectrum+target+for+anticancer+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).</li>
<li>Tumey, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+optimization+of+a+N-hydroxy+urea+series+of+flap+endonuclease+1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors.</a> Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).</li>
<li>Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+assay+of+FEN1+activity+with+nicking+enzyme-assisted+signal+amplification+based+on+ZIF-8+for+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells.</a> Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fragment+maturation+involves+%CE%B1-segment+error+editing+by+the+mammalian+FEN1%2FMutS%CE%B1+functional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex.</a> EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).</li>
<li>Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+FEN-1%2FPCNA+interaction+results+in+DNA+replication+defects%2C+pulmonary+hypoplasia%2C+pancytopenia%2C+and+newborn+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).</li>
<li>Hilda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+3D+cell+culture+technique+to+evaluate+the+half-maximal+inhibitory+concentration%3A+An+in+vitro+model+of+anticancer+drug+study+for+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).</li>
<li>Nadine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microstructure+analysis+of+polymer+amended+fluid+fine+tailings+using+Fiji-ImageJ+image+analysis+software%22">Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software</a>. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).</li>
<li>Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPablo%2C+T+%22Figshare%22">Figshare</a>. , (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Beyotime</td><td>ST774</td><td></td></tr><tr><td>30% Acr-Bis (29:1)</td><td>Beyotime</td><td>ST003-500ml</td><td></td></tr><tr><td>5M Nacl</td><td>Beyotime</td><td>ST347</td><td></td></tr><tr><td>BeyoBlue Plus</td><td>Beyotime</td><td>Pág. 0003S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) -FEN1</td><td>Vazyme</td><td>C504-F1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>Pág. P0007</td><td></td></tr><tr><td>Descolorando shaker</td><td>Kylin-Bell</td><td>TS-100</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Beyotime</td><td>ST041</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de banho seco</td><td>RUICHENG</td><td>DH200</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese</td><td>Bei jing Liuyi Biotecnologia</td><td>DDY-6D</td><td></td></tr><tr><td>FEN1-EM-4</td><td>AlvoMOL</td><td>T8545</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Takaba</td><td>9030</td><td></td></tr><tr><td>Slufate de canamicina</td><td>Biosharp</td><td>BS152</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de laboratório</td><td>Thermo</td><td>SL 16R</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>Solarbio</td><td>L8291</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Sua Resina de Ligação</td><td>7se biotecnologia</td><td>PANF001-001C</td><td></td></tr><tr><td>Odisseia FC</td><td>ODISSÉIA</td><td>LI-COR</td><td></td></tr><tr><td>PÁGINA SDS</td><td>Beyotime</td><td>Pág. 0015L</td><td></td></tr><tr><td>Trição-x-100</td><td>Shyuanye</td><td>S15022</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease fen1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas

Fluorescence-Based Detection of FEN1 Nuclease Activity and Screening of Small-Molecule Inhibitors

Conforme mostrado na Figura 2A, o reagente de coloração se liga à proteína, fazendo com que a proteína apareça como uma faixa azul no gel. A primeira faixa contém a proteína marcada usada como referência de peso molecular, na qual a banda de proteína padrão BSA corresponde a um peso molecular de 70 kDa, e a banda de proteína de ácido nucleico FEN1 corresponde a um peso molecular de 45 kDa. Os resultados experimentais mostraram que a nuclease FEN1 apareceu como uma banda clara em aproximadame...

Detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease FEN1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas

FEN1 (Flap Endonuclease 1) is a key DNA nuclease involved in DNA replication and damage repair, playing a crucial role in maintaining genomic stability. ...

fluorescence-based-detection-fen1-nuclease-activity-screening-small

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

Foram desenvolvidos ensaios de atividade com base em RMN para identificar e caracterizar inibidores de duas enzimas de riboidrolase nucleósidas. Os protocolos são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli .

Ensaios de atividade com base em RMN para determinação da inibição de compostos, valores de IC50 , atividade Artifactual e atividade de células inteiras de Ribohidrolases nucleósidos

A atividade de nuclease alterada tem sido associada a diferentes condições humanas, subjacentes ao seu potencial como biomarcador. A metodologia modular e fácil de implementar a triagem apresentada neste artigo permite a seleção de sondas de ácido nucleico específico para aproveitar a atividade de nuclease como biomarcador da doença.

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Monitorar mudanças na temperatura de fusão de uma proteína alvo (ou seja,ensaio de mudança térmica, TSA) é um método eficiente para triagem de bibliotecas de fragmentos de algumas centenas de compostos. Apresentamos um protocolo TSA implementando fluoremetria nano-diferencial assistida por robótica (nano-DSF) para monitorar fluorescência triptofano intrínseca e dispersão de costas leves para triagem de fragmentos.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Esse protocolo introduz uma metodologia de triagem fluorométrica otimizada para identificar inibidores naturais de produtos e pequenas moléculas na síntese de proteínas. Sua praticidade o torna adequado tanto para o ensino de graduação em técnicas de descoberta de fármacos quanto para a implementação em campanhas de química medicinal.

Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Aqui, descrevemos um método para visualização celular, localização subcelular e análise quantitativa de focos enriquecidos com poli(ADP-ribose) (PAR) em células fixas de mamíferos. Este ensaio possibilita a quantificação dos locais de ativação de PARP induzida por danos ao DNA, incluindo aqueles associados à reparação por excisão de bases ou à quebra de fita simples, nos núcleos de células expostas à genotoxina.

Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente

Aprenda a detectar a atividade da nuclease FEN1 por fluorescência e triar inibidores de moléculas pequenas. Este ensaio bioquímico oferece uma solução segura e eficiente para pesquisas em terapia contra câncer.

Detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease FEN1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas

Explorar mais vídeos