Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

Desenvolvi métodos que permitem a montagem modular de DNA a partir de pequenas partes moleculares individuais até construções do tamanho dos cromossômicos, e reprogramar células com esses cromossomos artificiais. Uma inovação importante na área é o desenvolvimento de kits modulares de ferramentas de clonagem que permitem a montagem modular de construções multigênicas a partir de uma biblioteca de partes moleculares padronizadas. Kits de ferramentas modulares de clonagem são tipicamente projetados para clonar unidades de transcrição monocistrônicas.

Esse protocolo demonstra uma forma generalizável de montar unidades de transcrição policistrônicas com o kit de ferramentas de clonagem. Essa estratégia de clonagem de uma unidade de transcrição policistronizada permite que sequências codificantes sejam usadas de forma flexível, seja em uma unidade de transcrição individual ou em arranjos policistrônicos. Para começar, selecione as partes de Nível 0 a serem montadas em uma unidade de transcrição.

Esses devem incluir pelo menos um RBS, uma sequência de codificação e um terminador. Escolha a posição em que a unidade de transcrição será montada em operão. Com base na posição escolhida, selecione o plasmídeo aceitador correspondente e simule a montagem Golden Gate no SnapGene.

Na reação Golden Gate, use a enzima SAP1 para liberar o sítio de ligação do ribossoma, a sequência codificante e o terminador de seus respectivos plasmídeos e abrir o plasmídeo aceitador. Monte o sítio de ligação do ribossomo, a sequência codificante e o terminador no plasmídeo do aceitador de corte. Em seguida, para a reação Golden Gate, use uma pipeta para adicionar 50 femtomolos de cada inserto desejado e 50 femtomolos do plasmídeo aceitador.

Um microlitro de cada um dos 10x T4 DNA ligase buffer, T4 ligase e SAP1 em um tubo de reação. Depois, adicione água sem nuclease para levar o volume final a 10 microlitros. Coloque o tubo em um termociclador.

Execute 25 ciclos a 37 graus Celsius por três minutos, 16 graus Celsius por quatro minutos e 50 graus Celsius por 20 minutos. Depois, inative as enzimas a 80 graus Celsius por 20 minutos. Opcionalmente, pipete 0,5 microlitros de SAP1 para a reação GG e incube a 37 graus Celsius por uma hora.

Pipeteie cinco microlitros da reação misturados em 50 microlitros de células de E. coli quimicamente competentes. Realize uma transformação por choque térmico mergulhando o tubo em um banho-maria a 42 graus Celsius por 30 segundos, e depois coloque o tubo sobre gelo por dois minutos. Em seguida, incube as células em um mililitro de meio por uma hora para ajudar na recuperação.

A placa 100 microlitros da transformação se expande sobre uma placa de parafuso LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, escolha duas colônias brancas usando um laço de inoculação ou uma ponta de pipeta.

Inocule cada um em cinco mililitros de meio LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada a 250 rotações por minuto. Realize a extração de xadrez conforme as instruções do fabricante.

Digere um micrograma de DNA plasmático extraído adicionando um micrólitro de 10x tampão de digestão e um micrólitro de BBS1. Adicione água sem nuclease para obter o volume total de 10 microlitros e incube. Agora carregue o plasmídeo digerido em um gel de 1%agarose e execute eletroforese a 100 volts por 35 minutos.

Depois, faça uma imagem do gel e confirme a montagem correta do plasmídeo. Para montar uma construção de Nível M, escolha as unidades de transcrição de Nível 1 a serem montadas. Simule a montagem Golden Gate liberando a primeira e a segunda unidade de transcrição e o link final usando a enzima BBS1.

Simultaneamente, corte o plasmídeo aceitador e depois monte as três partes no plasmídeo aceitador para formar a unidade de transcrição policistrônica. O controle negativo para a montagem de plasmídeos de Nível 1, que não tinha parte terminadora, não produziu colônias, enquanto a reação completa produziu 292 colônias brancas e nenhuma vermelha. A montagem do construto multi-gene sem a segunda fita a 37 graus Celsius resultou em apenas duas colônias brancas, enquanto a montagem completa gerou nove colônias grandes e 435 colônias pequenas.

A 30 graus Celsius, o controle negativo para montagem multi-gênico resultou em quatro colônias brancas, enquanto a reação completa gerou mais de 1.500 colônias. O digesto BSA1 do plasmídeo aceitador PMA60 fornece a banda única esperada em 5.500 pares de bases. A digestão BSA1 de plasmídeos de 24 colônias revelou que 23 de 24 apresentaram o padrão correto de restrição de duas bandas em aproximadamente 4.300 pares de bases e 1.700 pares de bases.

Imagens por fluorescência mostraram forte fluorescência verde e ciano em colônias de placas contendo o indutor OC6, enquanto placas sem indutor apresentaram fluorescência mínima ou nenhuma.