Name: Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a montar operons policistrônicos usando clonagem modular (MoClo) com o kit In-Cloning. Este protocolo demonstra a montagem flexível de unidades de transcrição multicistrônicas a partir de partes moleculares padronizadas.

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<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
<li>Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+synthetic+ribosome+binding+sites+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ampicilina</td><td>Merck Life Science</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Ágar bacteriano</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Células competentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Mastercycler&nbsp; Cicladores Térmicos Nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de Microvolume EzDrop 1000</td><td>Blue-Ray Biotech</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Minipreparação para Plasmídeos GeneJET</td><td>Termo Científica</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>In- & Fora - Kit de Ferramentas de Clonagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer da ligase</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova&reg; &nbsp; 42/42R - Shaker Incubadora Empilhável</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>PhenoBooth+</td><td>Instrumentos Singer</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>SaVi</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>Espectinomicina</td><td>Merck Life Science</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Utensílios de laboratório padrão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligase de DNA T4</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Thermomix MM</td><td>B. Braun Biotech International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (moclo) usando o kit de ferramentas in-cloning

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

standardized-modular-assembly-polycistronic-operons-with-modular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve o BiFC-PALM ― uma combinação de microscopia de localização fotoativada e complementação de fluorescência bimolecular ― para avaliar as interações proteína-proteína. BiFC envolve a fusão de dois fragmentos de proteína fluorescente com duas proteínas de interesse que interagem. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos são aproximados, o que permite que as duas partes se juntem e reconstituam uma proteína fluorescente funcional. A fluorescência de um único fluoróforo é...

Microscopia de localização fotoativada acoplada à complementação de fluorescência bimolecular

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

As interações proteína-proteína são visualizadas em células com resolução espacial nanométrica combinando complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com microscopia de localização fotoativada (PALM). Descrito aqui é o uso de BiFC-PALM para interações Ras-Raf de imagem em células U2OS para visualizar o agrupamento em nanoescala e difusão de complexos Ras-Raf individuais.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Descrevemos um sistema de capas de oócitos e animais de Xenopus para a clonagem de expressão de genes capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente, e discutimos técnicas para a análise subsequente de tais genes. Este sistema é útil na identificação funcional de uma ampla gama de produtos gênicos.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Aqui, um fluxo de trabalho automatizado para realizar a montagem de "dispositivo" modular do DNA usando um método de montagem clonagem de DNA modular em robôs de manipulação de líquido é apresentado. O protocolo usa uma ferramenta de software intuitivo para gerar picklists líquido manipulador para combinatória DNA dispositivo biblioteca geração, que demonstramos usando duas plataformas de manipulação de líquidos.

Robótico líquido manipulação montagem de dispositivos modulares DNA automática

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

Um módulo de clonagem molecular adaptável da Gibson Assembly foi empregado em um formato de experiência de pesquisa de graduação (CURE) baseado em curso para alunos do curso de laboratório de biologia molecular. A avaliação dos resultados de aprendizagem dos alunos mostrou melhor compreensão e confiança na clonagem molecular após a conclusão do CURE, e novos plasmídeos foram clonados para pesquisa de biossíntese de produtos naturais.

Melhorando os resultados dos alunos com uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de clonagem molecular adaptável

Aprenda a montar operons policistrônicos usando clonagem modular (MoClo) com o kit In-Cloning. Este protocolo demonstra a montagem flexível de unidades de transcrição multicistrônicas a partir de partes moleculares padronizadas.

Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

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