Modificação enzimática e avaliação por citometria de fluxo de proteínas exibidas na superfície de leveduras

Esta pesquisa se concentra em estudar as modificações químicas nas proteínas que ditam como as células se comportam. Nesse caso, o objetivo é entender as preferências e a cinética de enzimas que modificam uma variedade de substratos.

A capacidade de desfosforilar uma molécula de substrato exibida na superfície da levedura foi demonstrada pela primeira vez. Essa descoberta abre possibilidades para o mapeamento cinético generalizável de modificações enzimáticas que antes não eram acessíveis. Esta pesquisa aborda os desafios associados à compreensão das interações enzimáticas-substrato. Normalmente, lisados celulares ou peptídeos personalizados são necessários para esse tipo de avaliação. Aqui, uma alternativa FasL é fornecida através do uso de substratos exibidos em leveduras.

Este protocolo avança a exibição tradicional da superfície da levedura para a análise do que normalmente seriam reações enzimáticas intracelulares no espaço extracelular, permitindo a análise FasL dessas interações normalmente difíceis de avaliar.

Este protocolo permite interrogar as preferências de substrato de uma variedade de enzimas por meio de métodos de alto rendimento e realizar estudos cinéticos com uma leitura simples.

[Instrutor] Para começar, descongele uma alíquota das células de levedura preparadas no gelo. Adicione 0,5 a 1,5 microgramas de DNA de plasmídeo contendo a construção de exibição de levedura diretamente nas células. Em seguida, adicione 0,5 mililitros da solução de transformação ou uma solução estéril de polietilenoglicol a 50% e acetato de lítio 0,1 molar. Combine completamente a mistura de células, DNA de plasmídeo e solução de transformação por pipetagem. Incubar a mistura de transformação estaticamente por 30 a 60 minutos a 30 graus Celsius e vortex a mistura em intervalos de 15 minutos. Colha as células centrifugando a 1000G. Prepare um tubo de cultura de 14 mililitros com 4,5 mililitros de crescimento de células de levedura contendo plasmídeo, ou meio SDCAA. Ressuspenda as células contendo o plasmídeo desejado em 500 microlitros de SDCAA e inocule os 4,5 mililitros de meio preparados. Distribua 50 microlitros dos cinco mililitros de cultura inoculada em uma placa SDCAA com cuidado, sem perfurar a broca. Incubar estaticamente a 30 graus Celsius por 48 horas para determinar a eficiência da transformação. Agora, incube os cinco mililitros de cultura de células SDCAA em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 300 RPM por pelo menos 18 horas. Monitore a densidade óptica em 600 nanômetros após 16 horas e repita novamente após 20 horas. Quando a amostra atingir uma densidade óptica não superior a seis, centrifugue a cultura por três minutos a 2500G e descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet de levedura. Ressuspenda o pellet de levedura na indução da expressão da proteína, ou meio SRGCAA, até uma densidade óptica final de 600 nanômetros menor que um. Incubar a cultura de levedura em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 300 RPM por pelo menos oito horas, mas não mais do que 24 horas. Em seguida, meça a densidade óptica em 600 nanômetros para determinar a densidade celular. Prepare o tampão de trabalho para as amostras diluindo a solução tampão de trabalho 2X na proporção de um para dois com água deionizada em um frasco de 1,7 mililitro. Adicione o volume apropriado de cultura de levedura necessário para recuperar dois milhões de células de levedura no frasco de 1,7 mililitro para cada amostra. Centrifugue o frasco para injetáveis durante um minuto a 4500 G e, utilizando uma micropipeta, retire cuidadosamente e elimine o sobrenadante como resíduo de risco biológico. Ressuspenda as células peletizadas em um mililitro de PBSA antes de repetir a centrifugação e a remoção do sobrenadante. Deixe-o de lado. Prepare a solução de SHP-2 humana recombinante em uma concentração final de 1.000 nanomoles em um volume total de reação de 20 microlitros. Em seguida, adicione 7,7 miligramas de TDT em 10 mililitros de água deionizada em um tubo cônico de 15 mililitros para criar uma solução de TDT de cinco milimolares. Agora, pegue as células peletizadas e ressuspenda-as no tampão de trabalho para que o volume final da reação seja de 20 microlitros por amostra. Adicione dois microlitros da solução de DTT de cinco milimolares a cada amostra para uma concentração final de DTT de 0,5 milimolar. Adicione o volume preparado de SHP-2 a cada amostra para obter um volume final de 20 microlitros e misture suavemente usando uma micropipeta. Envolva as tampas dos frascos de amostra com Parafilm para evitar vazamentos ou contaminação cruzada. Incube as amostras a 37 graus Celsius por duas horas em um rotor a uma velocidade constante. Depois de remover as amostras do rotor, pare a reação adicionando um mililitro de PBSA a cada amostra antes de centrifugá-las novamente por um minuto. Em seguida, descarte o sobrenadante. Ressuspenda as amostras peletizadas em uma mistura de 20 microlitros de seus reagentes primários correspondentes e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Após 20 minutos, centrifugue amostras a 4500G por um minuto e descarte o sobrenadante como resíduo de risco biológico. Lave as células uma vez, ressuspendendo-as em um mililitro de PBSA antes de centrifugar as células novamente. Agora, ressuspenda as amostras em uma mistura de 20 microlitros de seus reagentes secundários correspondentes e incube por 15 minutos no escuro. Depois de centrifugar as amostras e descartar o sobrenadante, lave as células mais uma vez com PBSA antes de centrifugá-las novamente. Em seguida, ressuspenda as amostras lavadas em 300 a 500 microlitros de PBSA e transfira-as para tubos de poliestireno de cinco mililitros para análise de citometria de fluxo. Após preparar o citômetro, clique em File, seguido do botão New Experiment, nomeie o experimento e clique em Save para garantir que os dados adquiridos sejam salvos no caminho do arquivo desejado. Selecione o ícone de gráfico de pontos na barra de ferramentas superior para criar dois ou mais gráficos de pontos para cada amostra. Para um dos gráficos de pontos, certifique-se de que o nome do eixo x exiba o canal FSCA e o nome do eixo y exiba o canal SSCA. Para outro gráfico, selecione o nome do eixo x para exibir o canal no qual o reagente secundário direcionado ao anticorpo anti-epítopo primário fluoresce e o nome do eixo y para exibir o canal no qual o reagente secundário da estreptavidina fluoresce. Forneça um nome descritivo para a amostra clicando com o botão direito do mouse no tubo, selecionando Editar nome e inserindo o nome da amostra. Coloque cada sample tubo no suporte do citômetro e clique em Executar para começar a carregar a amostra e adquirir dados. Ajuste eventos, tempo e taxa de fluxo conforme necessário. Defina uma porta ao redor das células de levedura saudáveis no gráfico SSCA versus FSCA. Em seguida, registar a fluorescência de todas as amostras de controlo. Defina uma estratégia de gating para o gráfico criado antes de analisar as amostras tratadas. Registre a fluorescência de amostras desfosforiladas usando o citômetro e a estratégia de gating antes de analisar os dados usando o software de citometria de fluxo. Avalie a fosforilação medindo e comparando a mediana do eixo y das células que expressam proteínas em sua superfície e a fosforilação basal fornecida por células não reprodutoras entre amostras e controles. Por fim, calcule a diferença percentual de fosforilação mediana usando a fórmula fornecida. O efeito da variação das concentrações de fosfatase SHP-2 e dos tempos de incubação na diferença mediana de fosforilação em substratos exibidos na superfície da levedura é ilustrado nesta figura. A diferença percentual de fosforilação mediana diminuiu ao longo do tempo em todas as concentrações de SHP-2, com a maior desfosforilação observada na concentração de SHP-2 de 1.000 nanomolares em quatro horas. Após duas horas de incubação, 1.000 nanomolares SHP-2 resultaram em aproximadamente 48,8% de diferença mediana de fosforilação, significativamente menor do que a condição de 750 nanomolares no mesmo momento. Nenhuma diferença significativa na diferença mediana de fosforilação foi observada quando a incubação foi estendida de duas horas para três horas nas concentrações de SHP-2 de 500 nanomolares, 750 nanomolares e 1.000 nanomolares.