Name: Modificação enzimática e avaliação por citometria de fluxo de proteínas exibidas na superfície de leveduras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprenda a mapear cinética de modificações enzimáticas usando leveduras com substratos exibidos na superfície celular. Este método avalia a atividade de fosfatases como SHP-2 de forma simplificada.

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1. Crescimento celular de leveduras que abrigam plasmídeo e indução de expressão proteica
<ol>
	<li>Seguindo a receita descrita na Tabela 1, prepare o meio necessário para o crescimento de leveduras não contendo plasmídeo (YPD), crescimento de células de levedura contendo plasmídeo (SD-CAA) e indução da expressão de proteínas (SRG-CAA), bem como placas SD-CAA.</li>
	<li>Transforme o DNA do plasmídeo de exibição de levedura contendo o par quinase-substrato em células de levedura EBY-100 por meio do método baseado em cátion de lítio30,31, comumente adotado para uso em kits de transformação de levedura de vários fabricantes. NOTA: A eletroporação32 ou outras técnicas preferidas de transformação de plasmídeo de levedura podem ser usadas dependendo da construção do plasmídeo que está sendo transformada.</li>
	<li>Prepare um tubo de cultura de 14 mL com 10 mL de meio YPD. Inocular as células EBY-100 e crescer numa incubadora agitada a 30 °C, 300 rpm até que a cultura atinja uma densidade ótica (OD600nm) de 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 células/ml). NOTA: OD600nm é medido preparando cubetas de amostra de 3 mL contendo diluições 1:10 de culturas de levedura em seus respectivos meios e cubetas em branco de 3 mL contendo o meio usado para diluições de amostra. O programa OD600nm no espectrofotômetro é usado para medir primeiro a cubeta em branco e, em seguida, cada cubeta de amostra, definindo a diluição correspondente preparada para cada amostra. 1 OD600nm corresponde a 1 × 107 levedura/mL.</li>
	<li>Colha as células centrifugando a cultura a 1.000 x g por 3 min e lave com a1ª solução de lavagem fornecida no kit de transformação de levedura, ou TE (10 mM Tris-HCl e 1,0 mM EDTA) 31.</li>
	<li>Pellet as células novamente a 1.000 x g por 3 min e ressuspenda em 1 mL do tampão de transformação fornecido no kit de transformação de levedura ou água estéril. As células devem ser alíquotas em alíquotas de 50 μL e podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses.</li>
	<li>Para a transformação do plasmídeo, uma alíquota por plasmídeo é preparada e descongelada em gelo e, em seguida, 0,5-1,5 μg de DNA de plasmídeo contendo a construção de exibição de levedura é adicionada diretamente às células. Adiciona-se 0,5 mL da solução de transformação fornecida no kit de transformação de levedura, ou 0,5 mL de uma solução estéril de polietilenoglicol a 50% e 0,1 M LiOAc31. Combine a mistura de células, DNA de plasmídeo e solução de transformação completamente por pipetagem.</li>
	<li>Incubar a mistura de transformação estaticamente por 30-60 min a 30 ° C, mistura de vórtice em intervalos de 15 min. Colha as células centrifugando a 1.000 × g por 3 min.</li>
	<li>Prepare um tubo de cultura de 14 mL com 4,5 mL de meio SD-CAA. Ressuspenda as células contendo o plasmídeo desejado em 500 μL de SD-CAA e inocule os 4,5 mL preparados.</li>
	<li>Tomando cuidado para não perfurar o ágar, distribuir 50 μL dos 5 ml de cultura inoculada em uma placa de SD-CAA e incubar estaticamente a 30 °C por 48 h para determinar a eficiência da transformação.</li>
	<li>Incubar os 5 ml de cultura de células SD-CAA numa incubadora agitada a 30 °C, 300 rpm durante pelo menos 18 h. Monitore a densidade óptica (OD600nm) após 16 h e 20 h. Quando a amostra atingir uma densidade óptica suficiente não superior a 6, centrifugue a cultura por 3 min a 2.500 × g. Descarte o sobrenadante sem mexer no pellet de fermento.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet de levedura em SRG-CAA até um OD finalde 600 nm menor que 1 (&lt;1 × 107 levedura/mL).</li>
	<li>Incubar a cultura de levedura numa estufa agitada a 30 °C, 300 rpm durante, pelo menos, 8 h mas não mais de 24 h. NOTA: A indução da expressão proteica em células de levedura pode variar entre 20-37 °C. 30 °C é adequado para a síntese de pares quinase/substrato29,33, mas pode ser ajustado se considerado necessário para as proteínas específicas em estudo.</li>
	<li>Meça o OD600nm para determinar a densidade celular. NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste ponto armazenando as culturas de levedura a 4 °C.</li>
</ol>
2. Biotinilação do anticorpo 4G10 antifosfotirosina
<ol>
	<li>Ressuspenda um frasco de 2 mg de PEG4-NHS-Biotina até uma concentração final de 5 mM, adicionando 680 μL de PBS estéril. NOTA: A ressuspensão de PEG4-NHS-Biotina deve ser feita imediatamente antes da reação de biotinilação ser realizada. NHS hidrolisa em solução aquosa. O uso de PBS estéril e frascos para injetáveis é importante para a preparação de reagentes para armazenamento de longo prazo e para uso em ensaios baseados em células para mitigar quaisquer efeitos potenciais de contaminantes na viabilidade do reagente ou nos ensaios sensíveis que estão sendo realizados.</li>
	<li>Com base na concentração de anticorpos 4G10, adicione 100 μg de anticorpo em um frasco estéril de 1,7 mL.</li>
	<li>Adicione 1 μL do 5 mM PEG4-NHS-Biotina preparado da etapa 2.1 ao frasco contendo os 100 μg de anticorpo 4G10 para atingir uma proporção molar de biotina para anticorpo de 7,5:1. Pipete a mistura suavemente para homogeneizar a reação.</li>
	<li>Incubar a reação à temperatura ambiente com rotação constante durante pelo menos 2 h.</li>
	<li>Siga o protocolo do fabricante para colunas de dessalinização por centrifugação de 0,5 mL para trocar o tampão do 4G10 biotinilado (B-4G10) por PBS. NOTA: As colunas de dessalinização com um corte de peso molecular (MWCO) de 7 kDa são comumente usadas para biotinilação de anticorpos para permitir que a biotina não reagida e outras moléculas pequenas sejam removidas, mantendo o anticorpo maior.</li>
	<li>Diluir o anticorpo B-4G10 até uma concentração final de 1 μM em PBSA (PBS com 1 g/L de albumina sérica bovina). Aliquota o anticorpo B-4G10 em volumes menores para evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento. NOTA: Os anticorpos biotinilados podem ser armazenados a 4 °C para uso diário por até 3 meses sem perder eficiência significativa. Conservar as restantes alíquotas que não sejam utilizadas a -20 °C durante um período máximo de 2 anos.</li>
</ol>
3. Desfosforilação de substratos expressos na superfície da célula de levedura
<ol>
	<li>Prepare a solução tampão de trabalho 2x conforme descrito anteriormente na literatura34. NOTA: 2x é recomendado para facilitar a medição dos ingredientes necessários.</li>
	<li>Prepare o tampão de trabalho para as amostras em um frasco de 1,7 mL diluindo a solução tampão 2x preparada na etapa 3.1 1:2 em água deionizada. NOTA: O volume total de reação para cada amostra será de 20 μL, e cada amostra exigirá entre 10 μL e 18 μL de tampão de trabalho. Prepare tampão de trabalho suficiente para todas as amostras ou controles.</li>
	<li>Após a preparação recomendada da amostra descrita na Tabela 2, rotule os frascos de 1,7 mL com o controle correspondente ou nome da amostra.</li>
	<li>Com base no OD600nm medido na etapa 1.9, calcule o volume de cultura necessário para recuperar dois milhões (2 × 106) de células de levedura da cultura de levedura correspondente para cada amostra.</li>
	<li>Adicione o volume de cultura de levedura calculado na etapa anterior no frasco de 1,7 mL para cada amostra.</li>
	<li>Centrifugue o frasco para injetáveis durante 1 min a 4.500 × g. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta e descarte como resíduo de risco biológico.</li>
	<li>Ressuspenda as células peletizadas em 1 mL de PBSA e repita a etapa 3.6. NOTA: É importante remover o máximo de sobrenadante possível sem perturbar as células peletizadas.</li>
	<li>Com base em sua concentração de estoque, calcule o volume de SHP-2 humano recombinante necessário para ter uma concentração final de 1.000 nM em um volume total de reação de 20 μL. NOTA: O SHP-2 recombinante deve ser aliquotado em pequenos volumes para que qualquer proteína usada em cada ensaio não tenha passado por mais de dois ciclos de congelamento e descongelamento. Qualquer SHP-2 que sobrar de uma alíquota depois de todas as amostras terem sido preparadas para um ensaio deve ser eliminada. As concentrações de estoque de enzimas recombinantes podem variar dependendo do número do lote. O SHP-2 recombinante é comumente formulado em uma concentração de estoque de 0,2-0,4 mg/mL. Para uma concentração estoque de 0,324 mg / mL SHP-2, isso corresponde a uma concentração estoque de 4,696 μM (SHP-2 tem um peso molecular de 69 kDa). 4,26 μL do estoque de SHP-2 em uma reação de 20 μL resulta em uma concentração final de reação de 1.000 nM SHP-2.</li>
	<li>Adicione 7,7 mg de DTT em 10 mL de água deionizada preparada em um cônico de 15 mL para criar uma solução de DTT de 5 mM. Se as limitações do equipamento dificultarem a pesagem de miligramas, adicione 0,77 g de DTT a 10 mL de água deionizada e, em seguida, execute uma diluição de 100x para criar a solução de DTT de 5 mM usada para o ensaio. NOTA: A solução de TDT pode ser preparada em soluções de estoque de concentração mais alta para serem diluídas a 5 mM se não for possível medir quantidades em escala de miligramas usando o equipamento disponível. A solução de TDT precisa ser preparada fresca antes da ressuspensão celular em tampão de trabalho devido à sua tendência à hidrólise, tornando-a instável por longos períodos quando diluída em água.</li>
	<li>Ressuspender as células peletizadas no tampão de trabalho preparado na etapa 3.2 de modo que o volume final de reação em cada amostra ou controle seja de 20 μL. NOTA: A quantidade de tampão de trabalho adicionada deve ser calculada com base na quantidade de DTT (2 μL) e SHP-2 (calculada na etapa 3.8) que estará em cada amostra.</li>
	<li>Adicionar 2 μL da solução de DTT de 5 mM preparada na etapa 3.9 a cada amostra ou controle para uma concentração de reação final de 0,5 mM de DTT.</li>
	<li>Adicione o volume de SHP-2 calculado na etapa 3.8 a cada amostra para um volume final de 20 μL e misture suavemente usando uma micropipeta.</li>
	<li>Envolva as tampas dos frascos de amostra em parafilme para evitar vazamento ou contaminação cruzada.</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 °C durante 2 h num rotor a uma velocidade constante.</li>
	<li>Remova as amostras do rotor e interrompa a reação adicionando 1 mL de PBSA a cada amostra.</li>
	<li>Repita a etapa 3.6.</li>
</ol>
4. Marcação celular e análise por citometria de fluxo de substratos desfosforilados
<ol>
	<li>Ressuspenda as amostras da etapa 3.16 em uma mistura de 20 μL de seus reagentes primários correspondentes, conforme descrito na Tabela 2. Incube as amostras por 20 min em temperatura ambiente. NOTA: Todas as concentrações de reagentes utilizadas foram calculadas como excedentes em relação ao número de proteínas expressas na superfície das células de levedura. O cálculo pressupõe a expressão de 10.000 proteínas/célula de todas as leveduras 2 x 106 em uma amostra35, quando rotineiramente apenas ~ 50% delas o fazem. A Tabela 3 mostra a taxa de reagentes de marcação em excesso para cada um dos reagentes expressa na Tabela 2, calculada da seguinte forma: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Centrifugue amostras a 4.500 × g por 1 min e descarte o sobrenadante como resíduo de risco biológico.</li>
	<li>Lave as células uma vez, ressuspendendo em 1 mL de PBSA. Repita a etapa 4.2.</li>
	<li>Ressuspender as amostras numa mistura de 20 μL dos seus reagentes secundários correspondentes, conforme descrito no quadro 2. Incubar amostras por 15 min na ausência de luz.</li>
	<li>Repita a etapa 4.2.</li>
	<li>Repita a etapa 4.3.</li>
	<li>Ressuspenda as amostras lavadas em 300-500 μL de PBSA e transfira para tubos de poliestireno de 5 mL para análise imediata usando um citômetro de fluxo apropriado. NOTA: Se for necessário transportar amostras, mantenha em gelo úmido. Não é recomendado, mas as amostras podem ser armazenadas a 4 °C por no máximo 2 h como pellets úmidos.</li>
	<li>Depois de executar a inicialização e a preparação necessárias do citômetro para um novo experimento, clique no botão Novo experimento no menu Arquivo , nomeie o experimento e clique em Salvar para garantir que os dados adquiridos sejam salvos no caminho de arquivo desejado.</li>
	<li>Selecione o ícone de gráfico de pontos na barra de ferramentas superior para criar dois ou mais gráficos de pontos para cada exemplo a ser executado. Para um dos gráficos de pontos, selecione o nome do eixo X para exibir o canal FSC-A e o nome do eixo Y para exibir o canal SSC-A. Este gráfico mostra o Side Scatter - Área versus Forward Scatter - Area e é usado para bloquear células de levedura para análise posterior.</li>
	<li>Em outro gráfico de pontos, selecione o nome do eixo X para exibir o canal no qual o reagente secundário direcionado ao anticorpo anti-epítopo primário fluoresce. Selecione o nome do eixo Y para exibir o canal no qual o reagente secundário da estreptavidina fluoresce. Este gráfico mostrará apenas os eventos fechados do lado versus o gráfico de dispersão direta como células de levedura e é usado para exibir a fosforilação da tirosina no eixo Y e a expressão da superfície do substrato no eixo X. NOTA: O reagente secundário direcionado ao anticorpo anti-epítopo primário fluoresce no canal FITC (AF-488) e o reagente secundário estreptavidina fluoresce no canal AF-647 neste exemplo. Os canais usados podem variar dependendo dos reagentes primários e secundários usados durante a rotulagem.</li>
	<li>Coloque cada sample tubo no suporte do tubo do citômetro e selecione Executar para o citômetro para começar a carregar a amostra e adquirir dados. Ajuste os eventos a serem exibidos, os eventos a serem registrados, o tempo a ser registrado e a taxa de fluxo de amostra, conforme necessário.</li>
	<li>Defina uma porta ao redor das células de levedura saudáveis no gráfico SSC-A vs FSC-A criado na etapa 4.9. A Figura 1 ilustra uma representação descritiva da estratégia de gating a ser aplicada. NOTA: No gráfico SSC-A versus FSC-A, 100.000 eventos para exibir e 50.000 eventos para registrar dentro da porta de levedura definida é uma boa diretriz para visualizar e coletar dados suficientes para análise posterior. Estratégias de gating mais rigorosas para selecionar levedura singlete podem ser aplicadas com base em um gráfico de Forward Scatter-Height versus Forward Scatter-Area, conforme relatado recentemente36. A estratégia de gating mostrada na Figura 1 corresponde a uma abordagem menos rigorosa, incluindo singleto e algumas leveduras duplas por meio de gating de dispersão.</li>
	<li>Registre a fluorescência de todas as amostras de controle usando um analisador de citometria de fluxo. As amostras de controle são coletadas rotineiramente primeiro para ajudar a definir uma estratégia de gating, conforme descrito abaixo na etapa 4.14.</li>
	<li>Defina uma estratégia de gating para seu gráfico criado na etapa 4.10 antes de analisar as amostras tratadas. A Figura 1 ilustra uma representação descritiva da estratégia de gating a ser aplicada.</li>
	<li>Registar a fluorescência das amostras desfosforiladas utilizando o citómetro de fluxo e a estratégia de passagem definida nos passos 4.12 e 4.14.</li>
	<li>Analise os dados de citometria de fluxo adquiridos usando um software de análise de citometria de fluxo.</li>
	<li>Avalie a desfosforilação medindo e comparando a mediana do eixo Y das células que expressam proteínas em sua superfície e a fosforilação basal fornecida por células não exibidoras entre amostras e controles. Calcule a diferença de fosforilação mediana percentual da seguinte forma: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

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<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
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<li>Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+sequestration+empowers+phosphorylation+profiling+on+the+yeast+surface%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface.</a> AIChE J. 68 (12), e17931(2022).</li>
<li>Kawai, S., Murata, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKawai%2C+S+%22Genetic+Transformation+Systems+in+Fungi%22">Genetic Transformation Systems in Fungi</a>. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).</li>
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<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Garrafas de mídia de 1 L&nbsp;</td><td>Microtubos Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1.7/2.0 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L SureOne Pontas de Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L SureOne Pipet Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Tubos de Poliestireno de Fundo Redondo</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Cubetas platic</td><td>MARCA</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; L SureOne Pipet Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Sorológicas de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Caseína (Ácidos Casamino)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica&nbsp;</td>Placa <td>de</td> Petri Bacteriológica 30243397 <td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>;</td><td>Gabinetes</td> de Biossegurança <td>Corning Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labconco</td><td>Logic Classe II, Tipo A2&nbsp; 302310102</td><td></td></tr><tr><td>Bioespectrômetro</td><td>Eppendorf</td><td>Kinetic 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Biorreagentes</td><td>Fisher BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>Citometria de Fluxo CytoFLEX Analisador&nbsp;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>CytExpert software</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Fisher biorreagentes</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-cabra FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Transformação de Levedura Frozen-EZ II&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de Propósito Geral</td><td>Marvel Scientific</td><td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-myc tag para cabras&nbsp;</td><td>Centrífuga Mictrotube Bethyl</td><td>A190-104A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>Mini Incubadora Refrigerada de Baixa Temperatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfotirosina de camundongo 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td>Controlador de Pipeta <td>Fisher bioreagents</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Rafinose</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>Proteína SHP-2 Ativa Humana Recombinante R</td><td>& Centrífuga</td> Refrigerada D Systems <td>1894-SH</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae levedura Cepa de exibição de superfície EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0002 New Brunswick Innova 42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Pipetas de Canal Único</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio Di-hidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico Heptahidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Balança de Carregamento Superior</td> Cloridrato de Tris <td>da Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de rotação Fisher</td><td>Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>Papel de Pesagem&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura</td><td>BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Colunas de Dessalinização&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

modificação enzimática e avaliação por citometria de fluxo de proteínas exibidas na superfície de leveduras

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

A análise de citometria de fluxo de uma réplica individual de nosso sistema modelo incubado por 2 h sem (Figura 1A) e com (Figura 1B) 1.000 nM SHP-2 revela uma diferença mediana de fosforilação de 63,6%, que é definida como a razão da mediana do eixo Y (fosforilação) de todos os eventos exibidos na superfície menos o sinal de fosforilação da linha de base definido como a mediana do eixo Y dos eventos não exibidos entre a amostra tratada e o controle não tratado,...

Modificação enzimática e avaliação por citometria de fluxo de proteínas exibidas na superfície de leveduras

Yeast surface display is a genotype-phenotype linkage strategy that empowers high-throughput screening of protein function. Traditionally, yeast surface ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Este artigo descreve um protocolo fret-based do citometria do fluxo para quantificar o Self-assembly da proteína em células de S. cerevisiae e de HEK293T.

Detectando e caracterizando a auto-montagem da proteína in vivo por citometria de fluxo

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Este protocolo descreve as etapas essenciais para a realização de campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura para enriquecer as variantes de proteína que se ligam a um antígeno de interesse.

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em amostras de leveduras. O ensaio emprega dois corantes fluorescentes, SYTO 9 e iodeto de propídio (PI), para quantificar a integridade da membrana plasmática. Ele usa citometria de fluxo para fornecer estimativas quantitativas e reprodutíveis das frações de células vivas, mortas e danificadas para amostras de estresse pós-oxidativo.

Um ensaio LIVE/DEAD otimizado acoplado à citometria de fluxo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em células de levedura

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Aprenda a mapear cinética de modificações enzimáticas usando leveduras com substratos exibidos na superfície celular. Este método avalia a atividade de fosfatases como SHP-2 de forma simplificada.

Modificação enzimática e avaliação por citometria de fluxo de proteínas exibidas na superfície de leveduras

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