Name: Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Aprenda a analisar a internalização celular de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo imagem multi-espectral usando células RAW 264.7. Este método permite distinguir partículas internalizadas das ligadas à superfície.

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Os autores gostariam de agradecer o Prêmio ONR MURI-(NN00014-06-1-1176) e os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para financeira apoiar.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
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<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
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<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree amigo L. é empregada por Amnis Corporation, que fabrica o sistema X ImageStream.

Estudos têm demonstrado que as nanopartículas biodegradáveis ​​à base de poli (ácido láctico-co-glicólico (PLGA), ou polianidridos podem ser utilizados para entregar antigénios encapsulados ou drogas às células alvo. Uptake destas nanopartículas pelas células fagocíticas é importante para a sua eficácia, tornando assim quantitativa . análise de internalização crítico na concepção de novos sistemas de entrega de nanopartículas Ao utilizar este método, a absorção diferencial de nanopartículas por vários tipos de células p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Linha de células RAW 264,7 </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Nível de equipamento Premium </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-bem placa</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de cultura de células </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Raspador celular </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica sorovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipulator célula eletroquímica </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Processador líquido ultra-sônica </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> O tampão de lavagem </td><td> 2% de FBS inactivado calor, azida de sódio a 0,1% em PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampão de lavagem </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-visualizar microtubos tampa de encaixe </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor faloidina 660 </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corporação </td><td> 100200 </td><td> Opções: 658nm laser, amostrador automático </td></tr><tr><td> A azida de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por citometria de fluxo imagem

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Sistemas nanoparticulados surgiram como instrumentos valiosos na entrega de vacina através da sua capacidade para entregar eficientemente carga, incluindo proteínas, para as células apresentadoras de antigénio 1-5. Internalização de nanopartículas (NP) por células apresentadoras de antigénio é um passo crítico na geração de uma resposta imune eficaz para o antigénio encapsulado. Para determinar como as mudanças em função de nanopartículas impacto formulação, buscou-se desenvolver um alto throughput, protocolo quantitativo experimental que era compatível com a detecção de nanopartículas internalizadas, bem como bactérias. Até à data, duas técnicas independentes, microscopia e citometria de fluxo, têm sido os métodos utilizados para estudar a fagocitose de nanopartículas. A natureza de alto rendimento da citometria de fluxo gera robustos dados estatísticos. No entanto, devido à baixa resolução, ele não consegue quantificar com precisão internalizado contra células nanopartículas encadernados. Microscopia gera imagens com alta resolução espacial; however, é demorado e envolve amostras de pequenas dimensões 6-8. Multi-espectrais de citometria de fluxo de imagem (CFMI) é uma nova tecnologia, que incorpora os aspectos de microscopia e citometria de fluxo que executa várias cores de imagem de campo brilhante e fluorescência espectral simultaneamente através de um núcleo laminar. Este recurso fornece uma análise acurada da intensidade de sinal fluorescentes e as relações espaciais entre as diferentes estruturas e funções celulares em alta velocidade. Aqui, nós descrevemos um método utilizando CFMI para caracterizar as populações de células que têm internalizado nanopartículas polianidrido ou Salmonella enterica sorovar Typhimurium. Descrevemos também a preparação de suspensões de nanopartículas, de rotulagem celular, aquisição de um sistema X ImageStream e análise dos dados usando o aplicativo IDÉIAS. Nós também demonstrar a aplicação de uma técnica que pode ser utilizado para diferenciar o p internalizaçãoathways para as nanopartículas e bactérias por utilizando citocalasina-D como um inibidor da actina mediada por fagocitose.

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Sistemas nanoparticulados surgiram como ferramentas valiosas na entrega de vacinas devido à sua capacidade de entregar eficientemente a carga, incluindo proteínas, para...

Para analisar os mecanismos celulares de internalização de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo com imagem multiespectral. Primeiramente, os macrófagos são pré-tratados com citocalasina D para inibir a polimerização da actina. Nanopartículas ou salmonela são adicionadas ao macrófago em monocamada e incubadas.Em seguida, os macrófagos são colhidos, fixados e marcados para análise utilizando um sistema de imagem em fluxo. Células de citômetro de fluxo de imagem multiespectral que internalizaram nanopartículas e/ou salmonela são diferenciadas daquelas com nanopartículas e/ou salmonela ligadas à superfície. Os dados resultantes indicam que tanto a salmonela quanto as nanopartículas são internalizadas apenas por células que não foram tratadas com citocalasina.D sugerindo que a internalização é dependente de actina. Esta técnica apresenta diversas vantagens em comparação com métodos existentes, como citometria de fluxo e microscopia confocal. Principalmente, ela fornece uma medida precisa das intensidades do sinal fluorescente e resolução espacial entre diferentes características celulares em alta velocidade.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais tanto n

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Zhang, Y., et al. Aplicação de Nanopartículas Fluorescentes ao Estudo da Remodelação do Sistema Endolisossômico por Bactérias Intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar a remodelação endolisossômica em células epiteliais humanas infectadas por bactérias intracelulares. Após a invasão bacteriana, os patógenos manipulam o citoesqueleto do hospedeiro e o sistema endolisossomal, formando vacúolos com projeções tubulares que...

Visualização mediada por nanopartículas da remodelação endolisossômica em células infectadas por bactérias

Analisamos nossos resultados recentes sobre a integração de microscopia de fluorescência e ferramentas de imagem de citometria de fluxo em um telefone celular usando compactos e de baixo custo opto-fluídicos anexos. Estes celular baseado micro-dispositivos de análise pode ser útil para a análise citométrica, como a realização de tarefas de contagem de células diferentes, bem como para rastreio de alto rendimento de amostras, por exemplo, água em ambientes com recursos limitados.

Largo-campo microscopia de fluorescência e citometria de fluxo fluorescente de imagens em um telefone celular

Neste estudo, o objetivo principal foi monitorar a captação celular e eventual exocitose de nanotubos de carbono (NTCs). Nessa perspectiva, propusemos aqui um método único usando citometria de fluxo de imagem multiespectral permitindo uma quantificação e localização de CNTs em um número estatisticamente relevante de células.

Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Este artigo descreve métodos para a síntese e marcação fluorescente de nanopartículas (PN). As NPs foram aplicados em experiências de pulse-chase para rotular o sistema de endo-lisossomal de células eucarióticas. A manipulação do sistema de endo-lisossomal por actividades do agente patogénico intracelular, Salmonella enterica foram seguidas de imagem de células vivas e quantificada.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Este método demonstra uma técnica para avaliar a função dos granulócitos medindo simultaneamente a fagocitose de bactérias e a explosão oxidativa. A citometria de fluxo baseada em imagem permitiu a identificação de três subconjuntos distintos de granulócitos ativados que diferiam em sua capacidade funcional relativa.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

Análise de fluxo cytometric demonstrou ser valiosa para investigar culturas puras e monitoração dinâmica da comunidade microbiana. Apresentamos três abrangentes fluxos de trabalho, de recolha de amostras para análise de dados, para culturas puras e comunidades complexas em meio clara, bem como em matrizes desafiadoras, respectivamente.

Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

O ensaio de micronúcleos in vitro é um método bem estabelecido para avaliar a genotoxicidade e a citotoxicidade, mas marcar o ensaio utilizando a microscopia manual é trabalhoso e sofre de subjetividade e variabilidade interscorer. Este papel descreve o protocolo desenvolvido para executar uma versão inteiramente automatizada do ensaio usando a citometria do fluxo da imagem latente Multispectral.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

Este artigo apresenta a integração de um módulo de focalização espectral e um laser de pulso de dupla saída, permitindo imagens hiperespectrais rápidas de nanopartículas de ouro e células cancerígenas. Este trabalho tem como objetivo demonstrar os detalhes de técnicas ópticas não lineares multimodais em um microscópio de varredura a laser padrão.

Imagem Biomolecular da Captação Celular de Nanopartículas utilizando Microscopia Óptica Multimodal Não Linear

Este protocolo descreve uma abordagem quantitativa para medir a autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem.

Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Este estudo elucida o processamento fagocítico de partículas de Godanti Bhasma (GB) em células de mamíferos, caracterizando sua captação celular, dinâmica de vacúolos, acidificação e degradação. Essas descobertas não apenas avançam nossa compreensão dos mecanismos fundamentais de fagocitose, mas também estabelecem o GB como um sistema modelo promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Explorando os eventos celulares sequenciais de fagocitose desencadeados por Godanti Bhasma em células de mamíferos

Aprenda a analisar a internalização celular de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo imagem multi-espectral usando células RAW 264.7. Este método permite distinguir partículas internalizadas das ligadas à superfície.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

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