Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Analisar os mecanismos celulares de internalização de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo de imagem multiespectral. Os macrófagos são primeiro pré-tratados com citolaína D para inibir a polimerização da actina. Nanopartículas ou salmonelas são adicionadas ao macrófago, monocamada e incubadas.

Em seguida, os macrófagos são colhidos, fixados e rotulados para análise usando um fluxo de imagens. As células do citômetro de fluxo de imagem multiespectral que internalizaram nanopartículas e/ou salmonela são diferenciadas daquelas com nanopartículas ligadas à superfície e/ou salmonela. Os dados resultantes indicam que tanto a salmonela quanto as nanopartículas são internalizadas apenas por células que não foram tratadas com citoplasma.

D sugerindo que a internalização é dependente da actina. Esta técnica tem várias vantagens sobre os métodos existentes, como citometria de fluxo e microscopia confocal. Principalmente, ele fornece uma medida precisa das intensidades do sinal fluorescente e da resolução espacial entre diferentes características celulares em alta velocidade.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para pesquisas de vacinas e medicamentos de biomateriais, bem como para estudos de interação de patógenos. Isso inclui delinear as vias de internalização utilizadas por nanopartículas de polianidrido e bactérias. Geralmente, os indivíduos novos nesse método costumam ter dificuldades.

É importante gastar tempo titulando os corantes para obter sinais de fluorescência ideais. Além disso, conhecer o software e criar modelos de análise leva tempo. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando descobrimos que as nanopartículas poli-hidro exibem características de imitação de patógenos ao empregar microscopia e outras técnicas.

Em seguida, queríamos um sistema de alto rendimento para comparar os processos de internalização usados pela salmonela e as nanopartículas de hidreto de pólen antes de realizar o ensaio. Todas as culturas de células de mamíferos e bactérias devem ser colhidas e suspensões de nanopartículas devem ser preparadas. Comece colhendo células RA W2 64.7 confluentes usando um raspador de células.

Determine o número de células usando um hemocitômetro. Em seguida, coloque as células em uma placa de cultura de 24 poços a uma densidade de cinco vezes 10 elevado à quinta célula por poço em 0,5 mililitros. Incubar DMEM completo durante a noite a 37 graus Celsius e uma incubadora de 5% de CO2.

Para preparar a salmonela tarica diluída transformar salmonela em C-D-M-E-M para obter uma multiplicidade de infecção de cem por RA W2 64,7 células em um tubo de cultura de vidro com tampa de rosca de autoclave de 16 por 125 milímetros. Em seguida, usando papel de soro de leite esterilizado, pese cinco miligramas de nanopartículas de polianidrido carregadas com 1% de FITC geradas conforme descrito por colegas de Rean em sua publicação de 2009 e pesquisa farmacêutica em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione as nanopartículas a 0,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato frio e coloque-as no gelo.

Mantendo o tubo no gelo. Use um processador de líquido ultrassônico com uma microponta para sonicar a suspensão por aproximadamente 25 segundos a quatro a seis joules. Agora que todas as células e reagentes necessários estão prontos, o ensaio de fagocitose pode ser realizado.

Rótulo 24, placas de cultura de tecidos de poço contendo células RA W2 64.7 cultivadas em preparação para o ensaio na primeira placa. Cada uma das seguintes amostras será analisada em triplicata, cita e D com nanopartículas, cito e D com salmonela, meio com nanopartículas, meio apenas com nanopartículas de salmonela, apenas salmonela e AF seis células de coloração de 60 apenas quatro graus Celsius controles serão testados na segunda placa e incluirão meio mais nanopartículas e meio mais incubação de salmonela a esta baixa temperatura, processos celulares lentos, como fagocitose, uma hora antes da indução. Adicione cinco microgramas por mililitros de cyto e D e C-D-M-E-M aos poços apropriados e incube as células a 37 graus Celsius.

Após a incubação, vórtice a suspensão de nanopartículas e adicione 10 microlitros aos poços apropriados. Em seguida, vórtice a salmonela e adicione-a aos poços apropriados em um MOI de 100. Bata no prato algumas vezes para misturar.

Em seguida, colocar as placas de recolha a 37 graus Celsius e as placas de controlo negativo a quatro graus Celsius durante 45 minutos. Após a incubação, coloque as placas no gelo, lave as células duas vezes com PBS gelado sem cálcio e magnésio, aspirando e descartando o meio antigo para remover partículas não ligadas, salmonela e células mortas ou destacadas. Uso de magnésio pétala.

O pré-PBS nesta fase é essencial porque facilita o desprendimento celular do substrato Para colher as células, adicione 250 microlitros de PBS gelado e raspe suavemente os poços, pipete as células colhidas em tubos de microcentrífuga com tampa de encaixe siliconizados e mantenha-os no gelo. Lave as células adicionando um mililitro de tampão de lavagem a frio e centrifugue a 250 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, remova o tampão residual batendo no tubo de microcentrífuga invertido no papel.

Ressuspenda o pellet celular com uma toalha passando suavemente o tubo de microcentrífuga por um rack de tubo de ensaio. Para fixar as células, adicione 100 microlitros de 4% de formaldeído em PBS e deixe as células repousarem por 15 minutos. À temperatura ambiente, lave as células adicionando um mililitro de tampão de lavagem permanente e, em seguida, centrifugue a 250 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Depois de descartar o sobrenadante, remova o tampão residual como antes. Em seguida, corar as células RA W2 64.7. Para actina, adicione 100 microlitros de tampão de lavagem permanente contendo Alexa Fluora foid em seis 60 por 15 minutos.

À temperatura ambiente, as amostras não coradas devem ser incubadas com permanente, tampão de lavagem sem phin. Após a coloração, lave e centrifugue as células novamente, depois ressuspenda-as em 50 microlitros de PBS contendo 1% de PFA e armazene-as no escuro a quatro graus Celsius até a aquisição. Ligue, transmita imagens e inicie.

Inspire e inicialize os fluidos no menu de arquivos. Escolha carregar modelo padrão. Na galeria de imagens, menu de visualização, selecione tudo e pressione executar configuração para iniciar a imagem das contas, se necessário, ajuste o rastreamento do núcleo para centralizar as imagens lateralmente.

Selecione o canal de campo claro e clique em definir intensidade. Aguarde até que o coeficiente de variação da velocidade do fluxo seja consistentemente menor que 0,2%Na guia de assistência, clique em iniciar tudo para executar calibrações e testes e verificar se todos foram aprovados no software. Clique em carregar amostra.

Então, quando instruído a fazê-lo, coloque o frasco contendo a amostra mais brilhante. Com todos os fluorocromos no carregador de amostras, selecione a ampliação de 40 x. Uma vez estabelecidas as configurações do instrumento, não as altere durante todo o experimento.

Ligue cada laser no experimento clicando nos ícones de laser no software e defina a potência do laser para que cada fluorocromo tenha valores máximos de pixel entre 104.000 contagens, conforme medido nos gráficos de dispersão. Para eliminar a coleta de objetos indesejados, clique na janela do classificador de células no software. Em seguida, para coletar apenas dados de células, selecione o canal de limite inferior da área um para campo claro e defina o valor para objetos de 50 micrômetros com área inferior a 50 micrômetros serão considerados detritos e não serão adquiridos.

Selecione os canais a serem coletados clicando nos ícones de canal apropriados no software aqui. Os canais 1, 2, 3, 4, 5 e seis são selecionados na guia de configuração. Insira o número do arquivo e a pasta de destino.

Defina o número de sequência como um e o número de eventos a serem adquiridos como 5.000. Clique em executar, adquirir para coletar e salvar o primeiro arquivo de dados do experimento. Clique em FLL e execute a próxima amostra experimental.

Repita até que todas as amostras experimentais tenham sido coletadas. Em seguida, para executar os controles, clique em configurações de composição. Isso desligará o campo brilhante e espalhará o laser e permitirá a coleta de todos os canais de fluorescência na guia de aquisição.

Altere o valor de entrada para 500. Em seguida, coloque o tubo de controle e clique em executar. Adquira para coletar 500 células positivas em controles de coloração única.

Repita para cada fluorocromo no experimento para desenvolver uma matriz de compensação. Depois que todas as imagens de amostra forem adquiridas, inicie o software de análise de ideias em um computador de análise separado clicando duas vezes no ícone de ideias na área de trabalho. Clique duas vezes no assistente de internalização e carregue um dos arquivos RIF de amostra de teste.

Uma janela pop-up fornecerá instruções para carregar os arquivos de teste. Siga as instruções e clique no botão Avançar. Em seguida, clique em nova matriz.

Isso iniciará o assistente de compensação. Quando solicitado, selecione os arquivos de dados para os controles de cor única para adicioná-los. Clique em Avançar no assistente seguindo as instruções até que o arquivo de matriz de compensação seja salvo e carregado na caixa na etapa dois do assistente de internalização.

Clique em Avançar e siga as instruções até que um arquivo DAF seja gerado. Defina as propriedades de exibição da imagem selecionando os canais de imagem usados durante a aquisição. Clique no canal dois para FITC e no canal cinco para AF seis 60.

O campo claro e a dispersão lateral são selecionados por padrão. Selecione o canal de campo claro O para fazer o limite da célula e o canal O2 no qual as nanopartículas ou bactérias foram coletadas para a sonda de internalização para definir a população de células únicas, um gráfico de dispersão da área de campo claro versus proporção de campo claro de todas as células é gerado. A análise de alta taxa de transferência de vários arquivos de dados requer um arquivo de modelo e, portanto, é de importância crítica definir cuidadosamente as portas ao criar um arquivo de modelo.

Cada ponto representa os valores de uma imagem de célula individual. Clique em um único. em um gráfico para selecionar a imagem dessa célula específica na galeria de imagens.

Em seguida, desenhe uma porta ao redor das células com a área e a proporção que correspondem a eventos de célula única. As células únicas têm uma proporção de um redondo e dupletos. Ter uma proporção de cerca de 0,5.

Clique em várias células para diferenciar entre a região que contém células únicas e dupletos ou detritos. Para gerar um histograma da raiz do gradiente de campo claro, significa quadrado da imagem de campo claro. Clique no botão Avançar.

Em seguida, na guia de preenchimento, selecione a opção de compartimento para exibir o compartimento selecionado. Clique nas caixas para determinar onde as células e o melhor foco. Comece e desenhe uma região de linha para as células focadas na marcha.

Quanto maior o gradiente RMS, melhor focado, pule a próxima etapa, a menos que haja outras manchas para o portão. Um novo gráfico de dispersão da intensidade do canal dois no eixo x versus o pixel máximo do canal dois no eixo Y é gerado. Clique nos pontos e visualize as imagens para ajudar a determinar a região a ser desenhada ao redor das células que são positivas para nanopartículas ou bactérias.

Um histograma do recurso de internalização é gerado com uma região que começa em zero, que deve ser ajustada pela observação de imagens. A característica de internalização é uma razão entre a intensidade dentro da célula e a intensidade de toda a célula. É dimensionado de forma que, com um valor de zero, metade da intensidade esteja dentro.

O assistente criou uma região de cada célula que designa o interior, fazendo uma máscara que é usada, a entrada de imagem da célula para encontrar a superfície da célula e erodiu isso em quatro pixels. Observe que essa máscara pode ser ajustada manualmente para diferentes tipos de células quando necessário, criando uma máscara de objeto na imagem de campo claro primeiro e corroendo-a em mais ou menos pixels. O recurso de internalização é calculado com base nessa máscara de objeto erodido usando um algoritmo no software.

Esse recurso nos permite distinguir partículas e bactérias internalizadas que têm a maior parte de seu sinal fluorescente dentro do limite da máscara de partículas e bactérias ligadas à superfície, que têm a maior parte de seu sinal fluorescente fora do limite da máscara, conforme mostrado neste exemplo, criam um novo histograma com um novo recurso de internalização baseado na máscara de objeto erodido. Desenhe uma região para portar em células internalizadas visualizando as imagens no modo de compartimento selecionado. Defina o portão em 0.3.Aqui.

As células com pontuação inferior a 0,3 são consideradas células positivas de partículas ligadas à superfície. Para eliminar as células com marcação de fundo e identificar nanopartículas ou bactérias internalizadas específicas, escolha recursos no menu de análise. Clique no menu de análise.

Em seguida, clique no recurso de contagem de pontos ao lado para adicionar a contagem média de pontos ao relatório de estatísticas. No menu de relatórios, clique no ícone de relatórios. Em seguida, defina o relatório de estatísticas, adicione colunas e selecione a população de células apropriada.

Clique em OK. O assistente de internalização adicionará automaticamente estatísticas a esse relatório para salvar o arquivo de dados como arquivo de modelo a ser usado para análise em lote de todos os arquivos experimentais. Clique no menu de arquivo e selecione salvar como modelo.

Arquivos de modelo. Tenha a extensão dot AST para analisar vários arquivos de dados no software de ideias. Clique em ferramentas e selecione arquivos de dados em lote e insira todos os arquivos RIF.

Adicione o arquivo de matriz de remuneração e o arquivo de modelo nas seções correspondentes para enviar o lote para processamento, clique em enviar. Após a etapa de processamento, todos os arquivos RAF são analisados e os arquivos DAF são gerados para cada um dos arquivos brutos individuais. Um relatório final é gerado com estatísticas para todas as amostras para comparar o efeito da inibição da actina e da baixa temperatura na fagocitose de salmonela e nanopartículas.

As células RA W2 64.7 foram incubadas a 37 graus Celsius em meio, com ou sem cyto klain D ou incubadas em meio a quatro graus Celsius. Tanto a temperatura quanto as manipulações de actina reduziram a internalização de nanopartículas e salmonelas. No entanto, a incubação das células em cyto e D aumenta a porcentagem de células com nanopartículas ligadas à superfície enquanto diminui a porcentagem de células com salmonela ligada à superfície.

A porcentagem de células positivas para nanopartículas ligadas à superfície aumenta de aproximadamente 8% a 37 graus Celsius para mais de 35% após o tratamento com cito e D ou quatro graus Celsius. Em contraste, a porcentagem de células com salmonela ligada à superfície foi reduzida de 35% para 15% Após o tratamento com citoterapia e D, a incubação de células RA W2 64,7 com salmonela a quatro graus Celsius, diminuiu a internalização sem um aumento aparente na quantidade de bactérias ligadas à superfície em comparação com o controle de 37 graus Celsius. Juntos, esses dados demonstram que a salmonela e as nanopartículas são internalizadas por um processo celular semelhante que requer actina e depende da temperatura.

Além disso, os dados indicam que a ligação sustentada de salmonela a macrófagos requer polimerização de actina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como exa a internalização celular de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo de imagem multiespectral. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os inibidores são citotóxicos.

Portanto, experimentos prévios de perfil de citotoxicidade são necessários para determinar as concentrações ideais a serem usadas. Não se esqueça de que trabalhar com salmonela pode ser perigoso, precauções como usar o equipamento de proteção individual adequado e evitar a criação de aerossóis devem ser observadas ao realizar este procedimento.