Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

O desenvolvimento e otimização de biossensores para aplicações biotecnológicas é o escopo de nossa pesquisa. Especificamente, pretendemos entender como otimizar e projetar biossensores por meio da modulação de seus elementos genéticos. Escolhas de design orientadas pela intuição, como engenharia clássica de promotores e classificação celular por ativação de fluorescência, são técnicas rotineiramente aplicadas na caracterização e design de biossensores.

As metodologias de planejamento de experimentos ainda não foram amplamente adotadas no planejamento de circuitos genéticos. Por meio desse protocolo, buscamos aumentar a aceitação desses tipos de técnicas no design de circuitos genéticos e biossensores. Para começar, determine o tamanho teórico da biblioteca e calcule o número de variantes individuais necessárias para garantir uma cobertura superior a 95% da biblioteca.

Calcule o volume necessário de meio de caldo de lisogenia suplementado com antibióticos de acordo com o número de colônias a serem rastreadas. Abra o software de manipulação de líquidos e clique em executar ao lado do programa de transferência de líquidos MTP. Coloque o meio preparado na posição do reservatório correspondente.

Em seguida, encha o deck com placas de microtitulação vazias de acordo com o layout. Defina o programa para dispensar 200 microlitros de mídia. Clique em OK para confirmar o início do programa.

Agora, transfira os poços de placas de microtitulação preenchidos para uma plataforma de seleção de colônias e abra e transfira placas de trado quadradas de Pseudomonas putida transformadas com DNA de biblioteca de variantes de plasmídeo para a plataforma de seleção de colônias. Use o seletor de colônias para inocular cada poço pré-preenchido com uma única colônia das placas transformadoras. Feche novamente as placas inoculadas e transfira-as para uma incubadora de agitação offline.

Após a incubação, retorne as placas cultivadas à plataforma do manipulador de líquidos e solte. Clique em executar ao lado do protocolo adicionar glicerol ao MTP. Certifique-se de que o layout da placa na tela corresponda ao da doca do manipulador de líquidos.

E sequencialmente, clique em OK para que o protocolo seja executado. Quando terminar, feche as placas e misture-as brevemente em uma incubadora de agitação off-line a 800 rotações por minuto por cinco minutos. Codifique as placas e armazene a 80 graus Celsius até que seja necessário.

Calcule o volume necessário de meio suplementado com antibióticos para blocos de poços profundos. Clique em executar ao lado do programa de transferência de líquido DWB. Certifique-se de que a mídia seja adicionada ao reservatório correto.

Os blocos vazios de poços profundos estão nas posições corretas de layout e que um suprimento adequado de pontas está disponível. Defina o programa para dispensar 495 microlitros de mídia. Quando estiver pronto, clique sequencialmente em OK para iniciar o programa.

Agora, sele os blocos de poços profundos preenchidos com membrana respirável e transfira para armazenamento temporário a 4 graus Celsius. Em seguida, clique em executar ao lado do programa inocular do MTP descongelado. Certifique-se de que os estoques criogênicos MTP e os blocos de preenchimento de poços profundos sejam transferidos para a plataforma por layout e que pontas suficientes sejam carregadas.

Sequencialmente, clique em OK para inicializar. Quando o programa terminar, sele os blocos de poços profundos inoculados durante a noite com membrana respirável. Transfira-os para uma incubadora agitadora de placas off-line ajustada por 16 horas a 30 graus Celsius, 800 rotações por minuto e 75% de umidade.

Feche novamente, misture e retorne as placas de microtitulação de criostock ao freezer de 80 graus Celsius. Agora, calcule o volume necessário de meio suplementado com várias concentrações de efetores e antibióticos para que os blocos de poços profundos durante a noite sejam rastreados. Clique em executar ao lado do programa de transferência de líquido DWB.

Em seguida, certifique-se de que os reservatórios de mídia suplementados com efetores estejam posicionados corretamente. Adicione blocos vazios de poços profundos na plataforma do manipulador de líquidos. Quando dicas suficientes estiverem disponíveis, clique sequencialmente em ok para iniciar o protocolo para gerar blocos de poços profundos de ensaio.

Após o enchimento, sele os blocos de poços profundos do ensaio com membrana respirável. Reabasteça o manipulador de líquidos com pratos vazios. Repita a inoculação até que todos os blocos de ensaio estejam preenchidos.

Em seguida, clique em executar ao lado do programa DWB de transferência para ensaio. Depois que os blocos de poços profundos de ensaio não lacrados com meios suplementados com efetores forem colocados corretamente, transfira e solte os blocos de poços profundos durante a noite contendo P.putida crescida por layout. Clique sequencialmente em OK para iniciar o protocolo.

Quando o programa terminar, sele as placas de ensaio de transferência para a incubadora offline. Descarte os blocos de poços profundos durante a noite após a inoculação. Em seguida, transfira os blocos de poços profundos para uma centrífuga.

Células de pellets a 4.000 G em um rotor controlado por gelo a 18 graus Celsius por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, coloque os blocos centrífugos na plataforma do manipulador de líquidos. Calcule o volume de uma vez o PBS necessário com base no número de blocos de poços profundos a serem peneirados.

Clique em executar ao lado do ensaio, configure o programa DWB de ressuspensão PBS e defina o volume de distribuição para 500 microlitros. Em seguida, certifique-se de que o PBS seja adicionado ao reservatório correto e organize as placas centrifugadas de acordo com o layout. Clique em OK para iniciar o programa após confirmar a disponibilidade da gorjeta.

Sele novamente e remova os blocos de poços profundos ressuspensos do manipulador de líquidos. Verifique a parte inferior da placa para garantir que os pellets sejam completamente ressuspensos. Clique em executar ao lado das células de configuração do ensaio e do programa MTP da edição PBS.

Em seguida, transfira os blocos de poços profundos ressuspensos para o manipulador de líquidos de acordo com o layout. Carregue as placas de microtitulação vazias de acordo com o layout e defina o volume de distribuição para 200 microlitros antes de clicar em ok. Transfira as placas de microtitulação preenchidas para um leitor de placas multimodo off-line e meça a fluorescência relativa e o OD600.

A triagem automatizada de 5.000 variantes de promotores identificou os principais candidatos com ativação superior a 3,6 vezes. Os valores de EC 50 para 100 variantes únicas foram plotados para visualizar a distribuição de sensibilidade e identificar candidatos robustos. Os valores EC 50 foram calculados para 226 variantes enriquecidas e classificados usando a transformação Lin-log para formar uma biblioteca em escala de sensibilidade.

Um desenho de triagem definitivo foi construído usando variância de 1, 0 e 1 nível de quatro módulos. Os perfis do modelo Transport, Regulator, P-out e Output Ribosome-Binding Site revelaram como as mudanças nos níveis de expressão dos quatro módulos impactaram não linearmente o EC 50 e o coeficiente de Hill. Identificando combinações de expressão ideais com RBS-Out, mostrando um forte efeito positivo tanto na sensibilidade quanto na inclinação.

A variante de biossensor globalmente otimizada que incorpora os pontos fortes ideais do módulo demonstrou sensibilidade aprimorada e coeficiente de Hill em comparação com as versões otimizadas para pais e DSD.