Name: Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprenda a modelar infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas. Este método reproduz tolerância a antibióticos e acelera a descoberta de terapias eficientes contra infecções crônicas.

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Todas as experiências com o peixe-zebra descritas no presente estudo foram conduzidas na Universidade de Montpellier, seguindo os princípios 3Rs -Substituição, Redução e Refinamento- de acordo com as diretrizes da União Europeia para o manuseamento de animais de laboratório e foram aprovadas pela Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault e pelo Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques sob a referência CEEA-LR-B4-172-37. Todos os experimentos de infecção foram realizados em embriões até 5 dias após a fertilização. A criação de peixe-zebra adulto (Danio rerio) a partir do peixe AB ou Golden Lines aderiu às diretrizes internacionais especificadas pela Diretiva de Proteção Animal da UE 2010/63/UE. Instalação de peixe-zebra da Universidade de Montpellier com condições padrão definidas como um ciclo claro: escuro de 12 h:12 h, tanque de policarbonato de 3,5 L (máximo de 22 peixes por tanque) conectado a um sistema de recirculação com 4% de salinidade/400 μS de condutividade e temperatura da água de 28 °C. Os peixes foram alimentados 2x por dia com ração para peixes.
1. Preparação das soluções
<ol>
	<li>Prepare uma solução de trabalho 1x para água de peixe com ou sem azul de metileno para o crescimento de embriões de peixe-zebra (ver Tabela 1).</li>
	<li>Prepare 20x estoque (0,4%) e 1x solução anestésica de tricaína de trabalho, conforme descrito na Tabela 1. Para evitar o congelamento e descongelamento repetidos da solução-mãe, prepare alíquotas de 10 mL de 20x Tricaína e armazene a -20 °C.</li>
	<li>Prepare a solução de Triton a 2% diluída em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS; Tabela 1).</li>
</ol>
2. Preparação de inóculo de  P. aeruginosa fluorescente expressando GFP constitutivamente
NOTA: Todo o trabalho com P. aeruginosa é feito com as precauções BSL-2 em um gabinete de biossegurança. As cepas de P. aeruginosa devem ser geneticamente modificadas para expressar constitutivamente um repórter fluorescente, como GFP (como usado aqui e descrito em13). O uso de cepas com um repórter fluorescente codificado cromossomicamente é fortemente recomendado para evitar a perda de plasmídeo no caso de um repórter fluorescente codificado por plasmídeo.
<ol>
	<li>Aos 2 dias antes da infecção, riscar a partir de -80 ° C um estoque de P. aeruginosa geneticamente modificada expressando GFP em placas de ágar LB (Tabela 1) e incubar durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Verifique a fluorescência das colônias usando um microscópio fluorescente (Ampliação 6x) para inocular uma colônia GFP+P. aeruginosa em 1 mL de caldo LB (Tabela 1) e cresça durante a noite a 37 °C com agitação (180 rpm).</li>
	<li>No dia da infecção, dilua a cultura noturna de P. aeruginosa a 1:20 em 5 mL de caldo fresco LB. Cultivar as bactérias a 37 °C com agitação (180 rpm) até que a cultura atinja uma DO600 = 0,8. Isso deve levar aproximadamente 2-3 h.</li>
	<li>Centrifugar a cultura bacteriana durante 10 min à temperatura ambiente (RT) a 3584 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 4 mL de água de peixe sem azul de metileno.</li>
	<li>Adaptar o volume de cultura com água de peixe para ter 7 x 107 para 1 x 108 UFC/ml. Isso corresponde a um OD600 de aproximadamente 0,15 (a ser adaptado para cada cepa).</li>
	<li>Para quantificar o inóculo, fazer uma diluição seriada da suspensão bacteriana, colocar 20 μL da diluição 10-4 em uma placa de ágar LB e incubar durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Conte as colônias de GFP+ sob um microscópio fluorescente para determinar as UFCs do inóculo.</li>
</ol>
3. Colheita e preparação de embriões de peixe-zebra
<ol>
	<li>Aos 3 dias antes do experimento de imersão bacteriana, estabeleça casais reprodutores de peixe-zebra. Coloque um macho e uma fêmea reprodutores em um tanque de cruzamento.</li>
	<li>Na manhã seguinte, colete os óvulos após a fertilização usando uma peneira de malha fina. Coloque os ovos coletados em uma placa de Petri contendo água de peixe com azul de metileno.</li>
	<li>Para evitar contaminação, adicione 1 gota de água sanitária à placa de Petri. Após 5 min, troque a água do peixe por azul de metileno para remover o alvejante.</li>
	<li>Descarte os ovos com desenvolvimento embrionário anormal (os óvulos não fertilizados são semelhantes ao estágio de ovo de 1 célula) ou os mortos (aparência branca).</li>
	<li>Na manhã da infecção (a 2 dpf), descorione os embriões com duas pinças muito finas sob o microscópio estéreo (aumento de 11x). Rasgue o córion usando uma pinça sem beliscar o embrião para liberá-lo.</li>
	<li>Coloque os embriões descorionados em uma placa de Petri contendo peixes com azul de metileno. Incubar as placas a 28 °C até à infecção.</li>
</ol>
4. Lesão embrionária
<ol>
	<li>Anestesiar embriões de peixe-zebra em água de peixe sem azul de metileno, contendo 0,02% de Tricaína, aproximadamente 5 min antes da lesão em uma placa de cultura de células (35 mm x 10 mm). Os embriões não se movem mais e não respondem a estímulos.</li>
	<li>Coloque agulhas 25G no topo de dois pauzinhos para facilitar o manuseio das agulhas.</li>
	<li>Sob um microscópio estereoscópico, elimine embriões com desenvolvimento anormal ou mortos. Usando um movimento circular do prato, reúna todos os embriões no centro.</li>
	<li>Isole os embriões um a um usando duas agulhas na posição vertical (cabeça para baixo - cauda para cima) e coloque a agulha esquerda na cauda para mantê-la reta. Corte a barbatana na borda da notocorda com a agulha certa. Faça o corte de uma só vez. Não exceda 10 min entre o corte e a imersão na solução bacteriana.</li>
</ol>
5. Infecção de embriões feridos
<ol>
	<li>Sob a cabine de segurança biológica tipo II, vórtice e adicione a solução de P. aeruginosa a aproximadamente 1 x 107 UFC/mL a uma placa de 6 poços.</li>
	<li>Colete os embriões feridos com uma pipeta de vidro Pasteur descartável e adicione-os à solução bacteriana sob o poste de segurança microbiológica. Incubar a placa a 28 °C durante 1,5 h. NOTA: Se for necessário um grande número de larvas infectadas, faça grupos de cerca de 50 larvas, faça a ferida, mergulhe-as e repita para o grupo seguinte.</li>
	<li>Após a infecção, lave os embriões sob o posto de segurança microbiológica conforme descrito abaixo.<ol>
		<li>Transfira os embriões com uma pipeta de vidro para lavagem em 10 mL de água de peixe sem azul de metileno, adicionando o mínimo de líquido possível, por 30 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfira os embriões infectados novamente usando uma pipeta de vidro para uma segunda lavagem em 4 mL de água de peixe sem azul de metileno por alguns minutos.</li>
		<li>Transferir 24 embriões infectados individualmente para uma placa de vários poços com 1 mL de água de peixe sem azul de metileno.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque as placas em uma caixa de plástico na incubadora a 28 °C. Umidifique a caixa (com papel toalha úmido, por exemplo) para limitar a evaporação.</li>
</ol>
6. Sobrevivência de embriões infectados
<ol>
	<li>Para estudos de sobrevivência embrionária, verifique a viabilidade sob um microscópio estéreo em 18 h, 24 h e 48 h pós-infecção (hpi). Um embrião é considerado morto quando o coração e a circulação sanguínea param.</li>
	<li>Represente as taxas de mortalidade/sobrevivência usando representações gráficas de escadas de Kaplan-Meier (GraphPad Prism 8.3.0) e analise os dados com um log-rank ou outros testes estatísticos apropriados.</li>
</ol>
7. Contagem da carga bacteriana em embriões infectados (Figura 1)
<ol>
	<li>Realize a determinação de UFC de embriões infectados em quatro pontos de tempo diferentes: 1,5 hpi, ou seja, diretamente após a infecção, e após cada lavagem em 24, 48 e 72 hpi com 5 embriões / ponto de tempo. Execute todas as etapas sob o poste de segurança microbiológica.</li>
	<li>Prepare para cada larva infectada tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 95 μL de 1x PBS. O volume das larvas é de cerca de 5 μL.</li>
	<li>Transfira as larvas para uma placa de 6 poços com 4 mL de água de peixe sem azul de metileno para realizar uma lavagem e eliminar as bactérias planctônicas.</li>
	<li>Coloque cada embrião em um tubo de microcentrífuga contendo PBS, adicionando o mínimo de líquido possível. Basta tocar a pipeta de vidro contendo as larvas na superfície do PBS para permitir que as larvas afundem no tubo da microcentrífuga sem adicionar líquido.</li>
	<li>Esmague os embriões individualmente usando um pilão na lateral do tubo da microcentrífuga. Mantenha o pilão dentro do tubo. Determine o ponto final quando não houver mais embrião intacto.</li>
	<li>Levante o pilão e adicione 100 μL de PBS-Triton 2% para enxaguar qualquer bactéria residual do pilão (a concentração final é de 1%). Vórtice e aguarde 10 min. Não processe mais de cinco embriões ao mesmo tempo.</li>
	<li>Colocar 3x, 10 μL de lisados não diluídos em placas de ágar LB para cada embrião. Faça uma diluição em série dos lisados em uma placa de 96 poços até que uma diluição de 10-3 seja alcançada usando uma pipeta multicanal. Coloque 3x, 10 μL de diluição 10-1, 10-2 e 10-3 ao lado dos não diluídos em placas de ágar LB e incube as placas durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Contar ao microscópio as colónias fluorescentes de cada diluição e calcular o UFC por embrião infectado.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig1.jpg"> 
Figura 1: Linha do tempo experimental para avaliar a virulência e persistência bacteriana em embrião de peixe-zebra. Abreviaturas: UFC = Unidades formadoras de colônias, hpi = horas pós-infecção. O desenho foi criado com BioRender.com. O número foi modificado de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
8. Testando o tratamento contra infecção persistente (Figura 2)
<ol>
	<li>Prepare soluções antibióticas a 40x a concentração inibitória mínima (CIM) para a cepa de P. aeruginosa . Antes do experimento, verifique se a concentração escolhida de antibiótico não é tóxica para o embrião.</li>
	<li>Siga as etapas 7.1 e 7.2. Coloque 1 mL de água de peixe com antibióticos em uma placa de 24 poços e faça um controle sem antibióticos.</li>
	<li>Transfira cinco embriões da etapa de lavagem por tratamento para a placa de 24 poços, adicionando o mínimo de líquido possível.</li>
	<li>Incubar com os antibióticos por 30 min em temperatura ambiente. Retorne à etapa 7.3. quantificar a carga bacteriana após o tratamento.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig2.jpg"> 
Figura 2: Procedimento experimental usado para avaliar a eficácia de tratamentos com antibióticos em embriões infectados. Abreviaturas: ATB 30' = tratamento com antibióticos por 30 min, UFC = unidades formadoras de colônias, hpi = horas após a infecção. O desenho foi criado com BioRender.com. O número foi modificado de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<a href="https://app.jove.com/t/6639">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68464">10.3791/68464</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68464">Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

<table><tbody><tr><td>Meanossulfonato de etil-3-aminobenzoato</td><td>Sigma</td><td>E50521</td><td></td></tr><tr><td>Pellet de pistão</td><td>Eppendorf, Dutscher</td><td>33522</td><td></td></tr><tr><td>sais marinhos</td><td>Sistemas de aquário instantâneo para oceano &nbsp;</td><td>218035</td><td></td></tr><tr><td>Tritão</td><td>Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr></tbody></table>

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Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

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