Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas

A infecção crônica causada pela bactéria Pseudomonas aeruginosa é tolerante a antibióticos e muito difícil de tratar. Nosso objetivo é desenvolver um modelo in vivo que acelere a descoberta de terapias eficientes. Os medicamentos antibacterianos são principalmente rastreados in vitro, e testar medicamentos em camundongos cronicamente infectados é um desafio complexo. Para preencher a lacuna entre essas duas abordagens, propomos um modelo pré-clínico alternativo usando larvas de peixe-zebra feridas. Nosso modelo de infecção persistente em peixe-zebra baseado no uso de cepa clínica de Pseudomonas aeruginosa reproduz tolerância a antibióticos. Enquanto a microinjeção é comumente usada para infectar larvas de peixe-zebra, nosso método de ferimento reflete um modo de infecção natural e é adequado para a triagem de compostos terapêuticos.

[Narrador] Para começar, coloque agulhas de calibre 25 em cima de dois pauzinhos para facilitar o manuseio. Usando um microscópio estéreo, identifique e remova embriões que apresentem desenvolvimento anormal ou sejam inviáveis. Mova o prato em movimentos circulares para reunir os embriões restantes no centro. Agora, use duas agulhas orientadas verticalmente para isolar cada embrião, posicionando a agulha esquerda na cauda para manter o corpo reto. Com a agulha certa, faça um único corte na borda da notocorda para remover a barbatana. Complete cada corte rapidamente, garantindo que todos os embriões sejam imersos em solução bacteriana em 10 minutos. Para o procedimento de infecção, vórtice a solução de Pseudomonas aeruginosa sob uma cabine de segurança biológica tipo dois e adicione-a aproximadamente uma vez 10 à potência de sete unidades formadoras de colônias por mililitro a uma placa de seis poços. Use uma pipeta Pasteur de vidro descartável para coletar os embriões feridos e transferi-los para a solução bacteriana. Incube a placa de seis poços a 28 graus Celsius por 1,5 horas. Após a incubação, recupere os embriões infectados e coloque-os sob a segurança microbiológica para lavagem. Agora, transfira os embriões com uma pipeta de vidro para 10 mililitros de água de peixe sem azul de metileno, minimizando o volume transferido e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira os embriões novamente com uma pipeta de vidro para quatro mililitros de água de peixe sem azul de metileno e incube brevemente. Em seguida, com uma pipeta, transfira os embriões infectados individualmente para uma placa de 24 poços, adicionando um mililitro de água de peixe sem azul de metileno a cada poço. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora ajustada a 28 graus Celsius. Prepare tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 95 microlitros de PBS 1X para cada larva infectada. Transfira as larvas para uma placa de seis poços contendo quatro mililitros de água de peixe sem azul de metileno para lavar e remover as bactérias planctônicas. Coloque cada embrião lavado em um tubo de microcentrífuga com PBS, transferindo o mínimo de líquido possível. Agora, use um pilão para esmagar cada embrião contra a lateral do tubo da microcentrífuga, deixando o pilão dentro do tubo depois. Em seguida, levante o pilão e adicione 100 microlitros de PBS Triton a 2% para enxaguar as bactérias residuais do pilão, atingindo uma concentração final de 1%. Vortex o tubo e incube por 10 minutos. Em seguida, dispense três gotas de 10 microlitros de lisado não diluído de cada embrião em placas de ágar LB. Use uma pipeta multicanal para diluir serialmente cada lisado em uma placa de 96 poços até 10 elevado a menos três diluições. Por fim, dispensar três gotas de 10 microlitros das diluições junto às manchas não diluídas. E incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Todos os quatro isolados de Pseudomonas aeruginosa para fibrose cística foram significativamente menos virulentos no modelo embrionário lesado em comparação com a cepa de referência PAO1. Nos embriões infectados com dois isolados, a carga bacteriana foi acentuadamente reduzida ao longo de três dias, indicando eliminação bacteriana. Em contraste, os outros dois isolados, B6513 e RP73, mantiveram uma carga bacteriana relativamente estável de 18 a 65 horas após a infecção após uma queda inicial, sugerindo persistência. Um tratamento curto de 30 minutos com tobramicina 1,5 horas após a infecção reduziu drasticamente a carga bacteriana em embriões infectados com isolados B6513. A tobramicina não teve efeito significativo na carga bacteriana quando administrada 24 ou 48 horas após a infecção, demonstrando resistência durante os estágios persistentes da infecção.