Compreendendo as mudanças na morfologia mitocondrial por meio de micrografias de fluorescência dinâmicas e tridimensionais
August 15th, 2025
Aqui descrevemos o localizador de eventos mitocondriais (MEL), um plugin ImageJ útil na quantificação das mudanças tridimensionais na fissão mitocondrial e na atividade de fusão ao longo do tempo. Também descrevemos um pipeline de processamento de imagem útil para a limpeza de micrografias antes da análise no ImageJ.
O objetivo de nossa pesquisa é observar mudanças nas redes mitocondriais e investigar como essas redes mitocondriais mudam em resposta às condições celulares. Usamos ferramentas de código aberto como Fiji e Python, combinando bibliotecas existentes com macros e scripts personalizados para automatizar a análise da morfologia mitocondrial a partir de dados complexos de microscopia de fluorescência. Obter dados quantitativos confiáveis e métricas que descrevam a dinâmica da fissão e fusão mitocondrial com sua localização em 3D continua sendo um desafio.
A padronização para essa geração de dados não está comumente disponível. Portanto, existe um conhecimento limitado sobre a frequência de fissão e fusão específica da célula e a localização intracelular. Adicionamos a detecção de vida de fissão e fusão mitocondrial às métricas de pesquisa disponíveis.
E combinando-os com a contagem da estrutura mitocondrial, fomos capazes de definir uma nova métrica para entender a dinâmica da rede mitocondrial. Nossas descobertas nos permitem caracterizar parâmetros específicos de fissão e fusão celular e, pela primeira vez, determinar se o sistema mitocondrial está em equilíbrio ou em mudança. Isso evita grandes interpretações errôneas de fenótipos na saúde e na doença e fornece uma estrutura clara para relatórios precisos.
Para começar, abra o arquivo raw no ImageJ. Ajuste as configurações de cor para aumentar a visibilidade da região de interesse, mas não defina nada. Duplique a imagem de acordo com o número de células únicas que precisam ser analisadas.
Se várias células estiverem presentes em um campo de exibição, navegue até Analisar, Ferramentas e use a ferramenta Janelas sincronizadas e a ferramenta Desenho à mão livre para desenhar uma região de interesse em torno de uma célula de interesse e, em seguida, selecione Editar e escolha Limpar fora para isolar a célula selecionada. Separe os canais vermelho e azul um do outro e salve o canal mitocondrial como um arquivo tif. Para gerar uma função de difusão de ponto ou PSF, reabra a imagem raw.
Em seguida, abra o plug-in do gerador PSF selecionando Plug-ins, escolhendo Gerador PSF e selecionando o Modelo Óptico 3D Born wolf. Abra as informações da imagem raw selecionando Imagem e, em seguida, escolhendo Mostrar informações ou pressionando I no teclado. Role até a parte inferior da janela de informações da imagem.
Selecione a opção de tamanho e profundidade do voxel e altere o comprimento de onda para 568 nanômetros. Defina o Pixelsize XY para 166,1 nanômetros, Z-step para 200 nanômetros. Defina o Tamanho XYZ para corresponder a uma resolução de imagem de 512 x 512 e configure a pilha Z para conter 10 fatias Z.
Clique em Executar. Salve o PSF como um arquivo tif em sua própria pasta. Navegue até Plugins, selecione Macros e escolha Editar, seguido de Deconvolution_time_lapse_mine.
ijm para acessar a macro de deconvolução. Edite as linhas de entrada e saída conforme necessário e pressione Executar para executar a macro. Para aprimoramento e desfoque de contraste de imagem, navegue até Plug-ins, selecione Macros, escolha Editar e abra Pré-processamento.
ijm para acessar a macro de pré-processamento. Execute a subtração do fundo definindo o raio da bola rolante para 6. Defina o Sigma Filter Plus de forma que o raio seja definido como 1 vezes o fator de escala.
O número de pixels usados é 2 e a fração mínima de pixels é 0,2, garantindo que o plug-in esteja configurado para ter reconhecimento de exceções. Ajuste as configurações do CLAHE definindo o tamanho do bloco para 64, os compartimentos de histograma para 256, a inclinação máxima para 2,5 e a gama para 0,8 e clique em Executar. Abra um arquivo de interesse que tenha sido modificado usando o Pré-processamento.
ijm macros em ImageJ. Navegue até Plug-ins e selecione Limite adaptável. Defina o limite local para a média ponderada e ajuste o tamanho do bloco de pixels conforme necessário.
Clique em Visualizar e ajuste o tamanho do bloco para incluir claramente o maior número possível de mitocôndrias. Modifique o valor de subtração de cada célula para eliminar o fundo desnecessário e anote a micrografia resultante. Para otimizar o tempo, classifique as imagens em arquivos de acordo com o valor de subtração aplicado.
Agora navegue até Plugins, selecione Macros, escolha Editar e abra Threshold. ijm para acessar a macro de limite. Edite o script de macro para definir os caminhos corretos de entrada e saída, tamanho do bloco e valores de subtração.
Clique em Executar para executar a macro. Abra até 10 micrografias limiares que pertençam à mesma condição de tratamento. Navegue até Imagem, Pilhas, Ferramentas e selecione Concatenar, pressione OK.To remover pequenos pontos residuais deixados para trás pelo limite, vá para Plug-ins, seguido por Filtros de imagem integrais e selecione Remover valores discrepantes.
Use a visualização para ajustar os tamanhos X e Y para eliminar fragmentos. Salve o arquivo concatenado como um arquivo TIF. Por fim, navegue até Plugins, Macros, Editar, QuickTest_new.ijm.
Edite as linhas do caminho de entrada e saída para apontar para os diretórios apropriados, clique em Executar e visualize o localizador de eventos mitocondriais ou os resultados do MEL. A dinâmica mitocondrial foi rastreada ao longo do tempo com eventos de fissão de marcação de puncta vermelho e eventos de fusão de marcação de puncta verde em visualizações 3D e 2D. As redes mitocondriais mostraram diferenças específicas de tratamento na estrutura ao longo do tempo, com formas mais alongadas e interconectadas nas células tratadas com metformina e redes altamente fragmentadas nas células tratadas com metformina CCCP Baf.
O grupo CCCP Baf com metformina apresentou atividade de fissão e fusão significativamente maior do que os grupos controle ou apenas metformina, sugerindo aumento da remodelação mitocondrial. Este grupo também teve uma contagem mitocondrial significativamente maior, consistente com fragmentação aumentada. O volume mitocondrial foi significativamente reduzido no mesmo grupo, apoiando ainda mais uma mudança em direção à fissão.
No entanto, quando normalizado para o número mitocondrial, o grupo apenas com metformina exibiu a maior atividade dinâmica relativa, sugerindo que a metformina sozinha promove uma rede de remodelação mais ativa e eficiente, enquanto o co-tratamento impulsiona uma renovação estrutural extensa, mas menos eficiente.
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Visão Geral
Este estudo introduz o localizador de evento mitocondrial (MEL), um plugin ImageJ projetado para quantificar mudanças 3D na fissão e fusão mitocondrial ao longo do tempo. A pesquisa também descreve um pipeline de processamento de imagem para melhorar micrografias antes da análise.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Processamento de Imagem
Fundo
- As redes mitocondriais são cruciais para a função celular.
- Entender a dinâmica de fissão e fusão é essencial para insights sobre a saúde celular.
- Métricas padronizadas para esses processos estão faltando.
- Ferramentas existentes para análise frequentemente requerem personalização.
Propósito do Estudo
- Observar mudanças nas redes mitocondriais sob várias condições celulares.
- Automatizar a análise da morfologia mitocondrial a partir de dados de microscopia de fluorescência.
- Aprimorar a compreensão das frequências de fissão e fusão específicas para cada célula.
Métodos Utilizados
- Utilização de ferramentas de código aberto como Fiji e Python.
- Desenvolvimento de macros e scripts personalizados para automação.
- Implementação de um novo pipeline de processamento de imagem.
- Detecção de vida da fissão e fusão mitocondrial adicionada às métricas de pesquisa.
Principais Resultados
- Dados quantitativos confiáveis sobre a dinâmica mitocondrial foram alcançados.
- A padronização da geração de dados foi proposta.
- Insights sobre a localização mitocondrial em 3D foram fornecidos.
- Novas métricas para frequência de fissão e fusão foram estabelecidas.
Conclusões
- O plugin MEL auxilia significativamente na análise da dinâmica mitocondrial.
- Métodos padronizados podem melhorar a reprodutibilidade na pesquisa.
- Estudos adicionais são necessários para explorar o comportamento mitocondrial específico para cada célula.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative, three-dimensional analysis of mitochondrial fission and fusion dynamics is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular stress and drug response. The described pipeline and MEL plugin enable standardized, reproducible measurement of mitochondrial network remodeling, directly supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability enhances portfolio decision-making by clarifying cellular phenotypes in response to pharmaceutical intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of mitochondrial remodeling under compound treatment or stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing between equilibrium and shifting mitochondrial states.
- Provides standardized metrics for functional target validation in cell-specific contexts.
- Facilitates predictive confidence in linking mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological imaging data for downstream screening workflows.
- Standardizes image processing and event detection for reproducible assay outputs.
- Enables high-content screening of mitochondrial morphology changes across treatment groups.
- Supports reliable compound evaluation by quantifying fission, fusion, and network structure metrics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial dynamic metrics with disease-relevant cellular models when supported by data.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical phenotypic validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mitochondrial remodeling data.
- Supports mechanistic de-risking in translational research pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This pipeline integrates from early discovery imaging through lead identification and preclinical model validation, supporting hypothesis testing and mechanistic clarity at each stage.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial fission and fusion events to clarify pathway responses to interventions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound triage.
- Analytics: Provides standardized readouts for comparing treatment conditions and cellular phenotypes.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical model assessment when disease relevance is established.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, open-source workflow adaptable across cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial biology studies.
- Operational Value: Standardizes image analysis, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk by clarifying cellular responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs targeting mitochondrial function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis.
- Depends on access to open-source tools (ImageJ/Fiji, Python) and compatible computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and experimental models with appropriate parameter tuning.
- Limited by the need for high-quality 3D time-lapse imaging and careful threshold optimization.
