Compreendendo as mudanças na morfologia mitocondrial por meio de micrografias de fluorescência dinâmicas e tridimensionais

O objetivo de nossa pesquisa é observar mudanças nas redes mitocondriais e investigar como essas redes mitocondriais mudam em resposta às condições celulares. Usamos ferramentas de código aberto como Fiji e Python, combinando bibliotecas existentes com macros e scripts personalizados para automatizar a análise da morfologia mitocondrial a partir de dados complexos de microscopia de fluorescência. Obter dados quantitativos confiáveis e métricas que descrevam a dinâmica da fissão e fusão mitocondrial com sua localização em 3D continua sendo um desafio.

A padronização para essa geração de dados não está comumente disponível. Portanto, existe um conhecimento limitado sobre a frequência de fissão e fusão específica da célula e a localização intracelular. Adicionamos a detecção de vida de fissão e fusão mitocondrial às métricas de pesquisa disponíveis.

E combinando-os com a contagem da estrutura mitocondrial, fomos capazes de definir uma nova métrica para entender a dinâmica da rede mitocondrial. Nossas descobertas nos permitem caracterizar parâmetros específicos de fissão e fusão celular e, pela primeira vez, determinar se o sistema mitocondrial está em equilíbrio ou em mudança. Isso evita grandes interpretações errôneas de fenótipos na saúde e na doença e fornece uma estrutura clara para relatórios precisos.

Para começar, abra o arquivo raw no ImageJ. Ajuste as configurações de cor para aumentar a visibilidade da região de interesse, mas não defina nada. Duplique a imagem de acordo com o número de células únicas que precisam ser analisadas.

Se várias células estiverem presentes em um campo de exibição, navegue até Analisar, Ferramentas e use a ferramenta Janelas sincronizadas e a ferramenta Desenho à mão livre para desenhar uma região de interesse em torno de uma célula de interesse e, em seguida, selecione Editar e escolha Limpar fora para isolar a célula selecionada. Separe os canais vermelho e azul um do outro e salve o canal mitocondrial como um arquivo tif. Para gerar uma função de difusão de ponto ou PSF, reabra a imagem raw.

Em seguida, abra o plug-in do gerador PSF selecionando Plug-ins, escolhendo Gerador PSF e selecionando o Modelo Óptico 3D Born wolf. Abra as informações da imagem raw selecionando Imagem e, em seguida, escolhendo Mostrar informações ou pressionando I no teclado. Role até a parte inferior da janela de informações da imagem.

Selecione a opção de tamanho e profundidade do voxel e altere o comprimento de onda para 568 nanômetros. Defina o Pixelsize XY para 166,1 nanômetros, Z-step para 200 nanômetros. Defina o Tamanho XYZ para corresponder a uma resolução de imagem de 512 x 512 e configure a pilha Z para conter 10 fatias Z.

Clique em Executar. Salve o PSF como um arquivo tif em sua própria pasta. Navegue até Plugins, selecione Macros e escolha Editar, seguido de Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm para acessar a macro de deconvolução. Edite as linhas de entrada e saída conforme necessário e pressione Executar para executar a macro. Para aprimoramento e desfoque de contraste de imagem, navegue até Plug-ins, selecione Macros, escolha Editar e abra Pré-processamento.

ijm para acessar a macro de pré-processamento. Execute a subtração do fundo definindo o raio da bola rolante para 6. Defina o Sigma Filter Plus de forma que o raio seja definido como 1 vezes o fator de escala.

O número de pixels usados é 2 e a fração mínima de pixels é 0,2, garantindo que o plug-in esteja configurado para ter reconhecimento de exceções. Ajuste as configurações do CLAHE definindo o tamanho do bloco para 64, os compartimentos de histograma para 256, a inclinação máxima para 2,5 e a gama para 0,8 e clique em Executar. Abra um arquivo de interesse que tenha sido modificado usando o Pré-processamento.

ijm macros em ImageJ. Navegue até Plug-ins e selecione Limite adaptável. Defina o limite local para a média ponderada e ajuste o tamanho do bloco de pixels conforme necessário.

Clique em Visualizar e ajuste o tamanho do bloco para incluir claramente o maior número possível de mitocôndrias. Modifique o valor de subtração de cada célula para eliminar o fundo desnecessário e anote a micrografia resultante. Para otimizar o tempo, classifique as imagens em arquivos de acordo com o valor de subtração aplicado.

Agora navegue até Plugins, selecione Macros, escolha Editar e abra Threshold. ijm para acessar a macro de limite. Edite o script de macro para definir os caminhos corretos de entrada e saída, tamanho do bloco e valores de subtração.

Clique em Executar para executar a macro. Abra até 10 micrografias limiares que pertençam à mesma condição de tratamento. Navegue até Imagem, Pilhas, Ferramentas e selecione Concatenar, pressione OK.To remover pequenos pontos residuais deixados para trás pelo limite, vá para Plug-ins, seguido por Filtros de imagem integrais e selecione Remover valores discrepantes.

Use a visualização para ajustar os tamanhos X e Y para eliminar fragmentos. Salve o arquivo concatenado como um arquivo TIF. Por fim, navegue até Plugins, Macros, Editar, QuickTest_new.ijm.

Edite as linhas do caminho de entrada e saída para apontar para os diretórios apropriados, clique em Executar e visualize o localizador de eventos mitocondriais ou os resultados do MEL. A dinâmica mitocondrial foi rastreada ao longo do tempo com eventos de fissão de marcação de puncta vermelho e eventos de fusão de marcação de puncta verde em visualizações 3D e 2D. As redes mitocondriais mostraram diferenças específicas de tratamento na estrutura ao longo do tempo, com formas mais alongadas e interconectadas nas células tratadas com metformina e redes altamente fragmentadas nas células tratadas com metformina CCCP Baf.

O grupo CCCP Baf com metformina apresentou atividade de fissão e fusão significativamente maior do que os grupos controle ou apenas metformina, sugerindo aumento da remodelação mitocondrial. Este grupo também teve uma contagem mitocondrial significativamente maior, consistente com fragmentação aumentada. O volume mitocondrial foi significativamente reduzido no mesmo grupo, apoiando ainda mais uma mudança em direção à fissão.

No entanto, quando normalizado para o número mitocondrial, o grupo apenas com metformina exibiu a maior atividade dinâmica relativa, sugerindo que a metformina sozinha promove uma rede de remodelação mais ativa e eficiente, enquanto o co-tratamento impulsiona uma renovação estrutural extensa, mas menos eficiente.