Protocolo atualizado para montagem e uso do arranjo de minibiorreatores (MBRA)

Portanto, nossa pesquisa se concentra no microbioma intestinal, especificamente em como ele pode ser projetado para prevenir a colonização de patógenos nocivos. Ao mesmo tempo, também estamos interessados em entender as regras e mecanismos ecológicos por trás dessa resistência à colonização. A tecnologia, como sequenciamento de próxima geração, bioinformática avançada, camundongos livres de germes e modelos intestinais in vitro, estão transformando a maneira como estudamos as comunidades microbianas e seu papel na saúde e na doença.

Um dos maiores desafios com os modelos intestinais in vitro é operá-los com alto rendimento. O que precisamos são sistemas que permitam o interrogatório funcional das comunidades microbianas em escala. A matriz de minibiorreatores é um sistema de cultura de fluxo contínuo que foi projetado para resolver a falta de capacidade de produção em outros sistemas.

Isso nos permite ampliar os experimentos enquanto ainda captura o comportamento complexo e reprodutível da comunidade microbiana. Para começar, certifique-se de que as tiras de matriz do minibiorreator sejam impressas em 3D e contenham seis câmaras de biorreator independentes. Organize todos os componentes necessários para a montagem.

Usando uma torneira de fração 28 NF de 1/4 de polegada com uma chave de torneira com alça em T. Rosqueie as três portas de 1/4 de polegada em cada câmara para inserir as conexões. Depois de lavar a câmara com água, coloque uma barra de agitação magnética de 10 por 3 milímetros em cada câmara e adicione um mililitro de água destilada.

Em seguida, posicione uma arruela de borracha em cima de cada porta do biorreator. Para cada câmara, aparafuse uma isca macho rosqueada com canudo de mídia, uma isca macho rosqueada com canudo residual e uma isca macho rosqueada vazia nas portas. Agora insira seis septos de borracha em farpas de isca fêmea de 3/32 de polegada e dobre a manga superior de cada septo para baixo para cobrir o pescoço.

Conecte-os às portas designadas de cada câmara. Corte as tiras de tubos C-flex do comprimento e número desejados. Anexe uma farpa de isca fêmea de 1/8 de polegada a uma extremidade e um conector de trava de isca macho à extremidade oposta de cada comprimento de tubo.

Em seguida, insira uma farpa de isca fêmea de 1/16 de polegada em cada extremidade do tubo vermelho de duas paradas E-lab com um diâmetro interno de 1,14 milímetros e o tubo laranja de duas paradas E-lab com um diâmetro interno de 0,89 milímetros. Conecte a tubulação E-lab preparada à tubulação C-flex e certifique-se de que cada um dos seis comprimentos de tubulação C-flex esteja conectado a uma linha E-lab vermelha e laranja por meio de iscas fêmeas. Em seguida, corte o tubo C-flex em comprimentos diferentes, conforme necessário.

Anexe a farpa de isca fêmea de 1/8 de polegada e um conector de trava de isca macho em ambas as extremidades de uma peça de 3 polegadas e a peça de 12 polegadas do tubo C-flex. Prenda os conectores de trava de isca macho em ambas as extremidades das peças restantes. Monte a árvore da linha de resíduos de acordo com o diagrama 3D.

Conecte as extremidades expostas da tubulação vermelha de duas paradas do E-lab às travas de isca macho terminal na árvore da linha de resíduos em ordem crescente com base no comprimento da tubulação C-flex. Em seguida, conecte o tubo C-flex de 3 polegadas com a farpa de isca fêmea de 1/8 de polegada e o conector de trava de isca macho no topo da árvore da linha de resíduos. Monte a árvore da linha de alimentação de acordo com o diagrama 3D.

Faça a ponte entre as extremidades expostas da tubulação laranja de duas paradas do E-lab com as travas de isca macho terminal na árvore da linha de alimentação em ordem crescente com base no comprimento da tubulação C-flex e conecte a tubulação C-flex de 12 polegadas ao topo da árvore da linha de alimentação. Conecte o tubo C-flex de comprimento variável no final da árvore da linha de alimentação ao biorreator, organizando-os em ordem crescente da linha mais curta à esquerda para a mais longa à direita. Conecte a tubulação C-flex de comprimento variável no final da árvore da linha de resíduos à faixa do biorreator em ordem decrescente com a linha mais longa à esquerda e a mais curta à direita para acomodar a colocação da bomba.

Agrupe todas as linhas de alimentação C-flex no lado esquerdo da tira e prenda-as com uma braçadeira de torção. Forme um laço com a tubulação laranja de duas paradas do E-lab entre as linhas C-flex e prenda o laço usando fita de autoclave e repita o processo para a tubulação vermelha de duas paradas do E-lab no lado dos resíduos da tira do biorreator. Cubra a isca fêmea no final dos resíduos e alimente as árvores com papel alumínio para evitar contaminação.

Afrouxe as iscas rosqueadas macho com septos em cada câmara do biorreator para permitir que o vapor escape durante a autoclavagem. Depois de colocar o conjunto em uma caixa de autoclave, estique as árvores da linha de alimentação e resíduos em caixas separadas adjacentes àquela que contém as tiras de MBRA. Para conectar o sistema às bombas, remova a fita de autoclave que prende a tubulação do E-lab para as linhas de resíduos e alimentação e desamarre os feixes da tubulação C-flex.

Posicione o MBRA entre as duas bombas na parte superior da placa de agitação. Clamp-o usando os suportes impressos em 3D e alinhe-o com as posições de agitação marcadas na placa. Agora conecte a tubulação E-lab da linha de alimentação aos cartuchos da bomba peristáltica e posicione os batentes da tubulação nos slots dos cartuchos.

Repita o processo para a tubulação E-lab da linha de resíduos na bomba localizada à direita da placa de agitação. Em seguida, trave os cartuchos da bomba peristáltica na bomba. Organize o tubo C-flex ordenadamente usando os suportes de tubo impressos em 3D.

Conecte a extremidade da árvore da linha de resíduos à tubulação conectada às garrafas de resíduos. Em seguida, conecte a isca fêmea no tubo de entrada da linha de alimentação ao conector macho no tubo de 12 polegadas da tampa do frasco de mídia. Ligue ambas as bombas para iniciar o fluxo de mídia e certifique-se de que ambas as bombas estejam ajustadas para rotação no sentido horário quando os resíduos estiverem posicionados à direita das bombas.

Observe o tamanho e a cadência das gotículas em cada câmara do biorreator. Se alguma variabilidade ou anormalidade for notada, substitua a tubulação laranja de duas paradas do E-lab conectada à câmara afetada para reduzir a variação da vazão. Quando as câmaras estiverem cheias, desligue ambas as bombas e deixe os biorreatores descansarem por 24 a 48 horas para verificar se há contaminação antes de iniciar o experimento.

Mude a entrada do meio para um recipiente de um litro de alvejante a 10% em água deionizada e aumente a vazão em ambas as bombas ao máximo para deslocar o conteúdo das câmaras do biorreator com alvejante. Assim que as câmaras estiverem livres de meios, inverta o MBRA para desinfetar acima da linha de enchimento por cinco minutos. Após cinco minutos, endireite o sistema e aguarde mais cinco minutos para a esterilização.

Depois que as câmaras forem limpas de meio e esterilizadas por 10 minutos, substitua o alvejante por um litro de água deionizada e lave o sistema até que a água tenha passado. Em seguida, desconecte a tubulação do biorreator E-lab das bombas e remova os MBRAs. Remova os septos usados do biorreator e drene cada câmara até que reste apenas um mililitro de água.

Substitua os septos, a tubulação laranja de duas paradas do E-lab e autoclave a tira completamente montada, conforme demonstrado anteriormente. Após três ciclos de reutilização, siga estas etapas. Uma amostra fecal humana foi preparada e cultivada no sistema MBRA.

Após quatro dias de fluxo contínuo, a comunidade microbiana em todos os nove biorreatores foi dominada por 18 gêneros bacterianos, cada um compreendendo pelo menos 2% da abundância relativa em qualquer replicação. 22 dos 65 gêneros detectados estavam presentes em todas as nove réplicas de biorreatores, demonstrando alta reprodutibilidade. A análise da diversidade alfa mostrou variação mínima entre as réplicas nas unidades taxonômicas operacionais observadas e no Índice de Diversidade de Shannon.