Name: Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a purificar polipeptídeos semelhantes à elastina de E. coli usando extração com solvente orgânico. Este método rápido preserva a atividade das proteínas de fusão e oferece controle de endotoxinas para aplicações biomédicas escaláveis.

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<ol><li>Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides%3A+therapeutic+applications+for+an+emerging+class+of+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines.</a> J Control Release. 240, 93-108 (2016).</li>
<li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery.</a> J Control Release. 190, 314-330 (2014).</li>
<li>Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+elastin-like+polypeptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery.</a> Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targeting+of+immunosuppressants+using+a+bifunctional+elastin-like+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide.</a> Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally+responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+purification+of+elastin-like+polypeptides+directly+from+whole+cells+and+cell+lysates+by+organic+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction.</a> Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).</li>
<li>Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fast+organic+extraction-precipitation+method+for+improved+purification+of+elastin-like+polypeptides+that+is+independent+of+sequence+and+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).</li>
<li>Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+mechanism+of+elastin-like+polypeptide-enzyme+fusion+stabilization+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents.</a> Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+elastin-like+polypeptides+and+their+applications+in+drug+delivery+system+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair.</a> J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).</li>
<li>Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bioengineered+elastin-like+polypeptide-based+system+for+targeted+gene+delivery+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells.</a> Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).</li>
<li>Clement, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+the+recombinant+expression+and+chemical+synthesis+of+a+short+cysteine-rich+insecticidal+spider+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Venom+Anim+Toxins+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide.</a> J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).</li>
<li>Miranda, L. P., Alewood, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+chemical+synthesis+of+peptides+and+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).</li>
<li>Eweje, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+nanoparticles+for+cytosolic+delivery+of+nucleic+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins.</a> Nat Biotechnol. , (2025).</li>
<li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+purification+by+organic+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein purification by organic extraction.</a> Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).</li>
<li>Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+elastin-like+polypeptide-based+nucleic+acid+delivery+system+targeted+to+EGFR%2B+bladder+cancer+cells+using+a+layer-by-layer+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach.</a> Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).</li>
<li>Christensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+order+controls+expression+level+and+activity+of+elastin-like+polypeptide+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins.</a> Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrilamida/Bis-acrilamida</td><td>TCI</td><td>A3218</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Bio-Biotecnologia Ouro</td><td>A-301-25</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>APS (Persulfato de Amônio)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>L13171</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP118-500</td><td>Componente de Buffer de Lise</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Laboratórios de Descontaminação</td><td>UN1170</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Acetato de Etil</td><td>Fisher Scientific</td><td>E195</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>G22020-0.5</td><td>Componente de Mídia Terrific Broth (TB)</td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Componente de Buffer de Lise</td></tr><tr><td>Mancha instantânea de Coomasie</td><td>Abcam</td><td>ab119211</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bio-Biotecnologia Ouro</td><td>12481C25</td><td>Componente de Expressão de Proteínas</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>K2HPO4 (Monobósica de Fosfato de Potássio)</td><td>Ciência dos Wards</td><td>470302-246</td><td>Parte 2 Componente de Buffer</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibásico de fosfato de potásio)</td><td>Ciência dos Wards</td><td>470302-254</td><td>Parte 2 Componente de Buffer</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>P5200-500.0</td><td>Componente de Mídia Terrific Broth (TB)</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Bio-Biotecnologia Ouro</td><td>L-040-1</td><td>Componente de Buffer de Lise</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>Solvente orgânico</td></tr><tr><td>Buffer de Amostra Nativa</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0738</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Escada de Proteínas</td><td>Bio-Biotecnologia Ouro</td><td>P008-500</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Tamponador de Gel de Resolução</td><td>Bio-Rad</td><td>1610798</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodim Dodecil Sulfato (SDS)</td><td>Termo Científica</td><td>J18220-36</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Componente de Buffer de Lise</td></tr><tr><td>Buffer de Gel de Empilhamento</td><td>Bio-Rad</td><td>1610799</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP-152</td><td>Componente de Buffer de Lise</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>T60065-1000.0</td><td>Componente de Mídia Terrific Broth (TB)</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>Y20025-1000.0</td><td>Componente de Mídia Terrific Broth (TB)</td></tr></tbody></table>

purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (elps) de e. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

Efficient Purification of Elastin-Like Polypeptides (ELPs) from E. coli Using an Organic Solvent-based Extraction and Precipitation Method

Após passar pelas fases finais do protocolo, o próximo passo é a visualização do resultado extração-precipitação por meio da análise SDS-PAGE e coloração azul de Coomassie. Quando há uma etapa de lise antes da extração orgânica, uma faixa ELP proeminente deve ser evidente. No caso do ELP-I-Cm2, essa faixa aparece em 100 kDa (Figura 3A).
A triagem de diferentes combinações de solventes orgânicos demonstrou eficiências variáveis na extração (Fig...

Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

Elastin-like polypeptides (ELP) are engineered biopolymers built from repetitive pentapeptide sequences that mimic motifs found in mammalian tropoelastin. ...

efficient-purification-elastin-like-polypeptides-elps-from-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de...

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Neste vídeo, demonstramos cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa para purificar peptídeos de uma mistura de lisado de proteína digerida. Esses peptídeos purificados são então liofilizados e armazenados para aplicações a jusante. A análise de peptídeos pode ajudar a entender a mecânica envolvida na sinalização celular e no câncer.

Purificação de peptídeos: uma técnica baseada em RP-HPLC para extrair peptídeos de lisados de proteínas digeridas

Polipeptídeos Elastina-like são biopolímeros de estímulo-responsivo com aplicações que vão desde a purificação da proteína recombinante para a entrega da droga. Este protocolo descreve a purificação e caracterização de polipeptídeos elastina semelhantes e suas fusões de péptido ou proteína a partir de Escherichia coli utilizando o seu comportamento crítico de transição de fase inferior temperatura da solução como uma alternativa simples, a cromatografia.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

As tecnologias recombinantes permitiram que os projetistas de materiais criassem novas proteínas artificiais com funcionalidades personalizadas para aplicações de engenharia de tecidos. Por exemplo, proteínas artificiais da matriz extracelular podem ser projetadas para incorporar domínios estruturais e biológicos derivados de ECMs nativos. Aqui, descrevemos a construção e purificação de proteínas aECM contendo repetições semelhantes à elastina.

Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para engenharia de tecidos da pele

O protocolo prevê uma metodologia para solubilizar lodo granular aeróbica, a fim de extrair polímeros extracelulares de alginato-like (ALE).

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

O presente protocolo descreve a precipitação de proteínas à base de solventes em condições controladas para recuperação e purificação robustas e rápidas de amostras de proteome antes da espectrometria de massa.

Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Aprenda a purificar polipeptídeos semelhantes à elastina de E. coli usando extração com solvente orgânico. Este método rápido preserva a atividade das proteínas de fusão e oferece controle de endotoxinas para aplicações biomédicas escaláveis.

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