Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

O escopo dessa pesquisa questiona se a precipitação por extração por solvente pode purificar rapidamente proteínas de fusão ELP enquanto mantém a função de atividade de fusão. Desenvolvimentos recentes incluem a rápida purificação de ELP à base de solvente com controle aprimorado das endotoxinas, permitindo nanopartículas auto-montadas ativas para entrega direcionada de ácidos nucleicos. Para começar, pese um grama do pellet de células de E. coli.

Adicione quatro mililitros de tampão de lise recém-preparado para ressuspender o pellet celular. Faça vórtice suavemente até que o pellet esteja totalmente disperso e misture com o tampão. Adicione aproximadamente cinco miligramas de lisozima às células ressuspensas para auxiliar na digestão da parede celular.

Depois, coloque o tubo no gelo e incube por uma hora. Após a incubação, sonice a amostra usando um sonater de sonda micro-ponta em intervalos de cinco segundos. Mantenha a amostra no gelo e continue a sonicação até que um lisado uniforme, livre de partículas visíveis, seja obtido normalmente por cinco a oito minutos.

Centrifuge o lisado sonicado a 10.000 G por 10 minutos a 20 graus Celsius para esclarecer. Depois, separe cuidadosamente o sobrenadante contendo a fração solúvel do pellet contendo a fração insolúvel. Pipete de 10 a 20 microlitros do sobrenadante e ressuspenda uma massa equivalente do pellet em um tampão de lise.

Misture ambas as frações com 4x tampão de Laemmli até uma concentração final de 1x. Depois, aqueça a suspensão a 95 graus Celsius por cinco minutos. Se o ELP for predominantemente solúvel, prossiga com a extração com solvente orgânico usando o sobrenadante clarificado.

Para realizar a extração com solvente, adicione quatro mililitros de solvente orgânico ou mistura de solvente ao pellet seco ao ar ou sobrenadante. Para misturas de solventes binários, use razões volumétricas exatas, como dois mililitros de cada para uma combinação um-para-um. Faça vórtice vigorosamente na suspensão por um minuto para garantir a penetração adequada do solvente no pellet.

Agora, incube a mistura a 20 graus Celsius por cinco minutos para permitir a agregação de proteínas extracelulares e a solubilização do ELP na fase orgânica. Centrifuge a amostra a 13.000 g por 10 minutos a 20 graus Celsius para separar proteínas solubilizadas dos detritos insolúveis. Colete cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet, pois ele contém o ELP solubilizado.

Meça o volume do sobrenadante coletado com precisão para se preparar para a precipitação. Em seguida, adicione acetona ou acetonitrila ao sobrenadante a 2,33 vezes seu volume para a precipitação de proteínas. Incube a mistura a 20 graus Celsius por cinco a sete minutos.

Centrifuge a amostra a 10.000 G por 10 minutos a 20 graus Celsius. Depois, descarte o sobrenadante e seque o pellet ao ar, seja sob um jato suave de nitrogênio por 10 a 15 minutos ou colocando tubos de centrífuga sem tampa de cabeça para baixo sobre lenços sem fiapos em uma exaustão por uma hora a 20 graus Celsius. Ressuspenda o pellet de proteína seco em 50 microlitros de PBS.

Depois, pipete suavemente para cima e para baixo para garantir a dissolução completa. Armazene a proteína ressuspensa a menos 20 graus Celsius para uso de curto a médio prazo. Para realizar a validação usando SDS-PAGE, primeiro misture a proteína purificada com o buffer de carregamento 4x SDS-PAGE.

Faça um vórtice breve na solução para homogeneidade. Coloque a amostra em um gel SDS-PAGE a 10% para ELP e TEEN fundidos para corismar mutase. Faça o gel funcionar de 100 a 120 volts até que o mergulho de rastreamento chegue ao fundo.

Agora, tinga o gel usando o corante InstantBlue Coomassie ou uma alternativa adequada por duas horas a 20 graus Celsius. Enxágue com água desionizada até que o fundo seja claro. Uma faixa proeminente de ELP e TEEN fundidas para corismar mutase apareceu em 100 kilodaltoneladas após uma etapa de lise antes da extração orgânica.

Diferentes combinações de solventes orgânicos resultaram em eficiências e purezas variadas de extração de ELP e TEEN fundidos para corismar mutase. As misturas um a um de AG e BG proporcionaram a maior recuperação de proteínas. O ELP e TEEN extraídos pelo solvente AG fundidos à mutase corismada manteve aproximadamente 80% de sua atividade enzimática em comparação com a proteína purificada por ITC, enquanto a BG manteve cerca de 50% de atividade, e o controle V40 mostrou quase nenhuma atividade.

Descobertas significativas incluem demonstração de que a precipitação por extração de solventes orgânicos purifica rapidamente fusões ELP com baixo índice de endotoxina, preservando a atividade das proteínas de fusão. Este protocolo aborda a falta de métodos rápidos sem detergente para purificar fusões ELP de E.Coli com ou sem corpos de inclusão, sem ITC em múltiplas etapas. Esse protocolo oferece uma purificação rápida em uma única etapa diretamente a partir de pellets de E. coli, resultando em fusões ELP altamente puras e com baixo teor de endotoxinas, preservando a função da proteína de fusão.