Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

O objetivo geral deste protocolo é expressar e purificar proteínas semelhantes à elastina derivadas recombinantemente para uso como um hidrogel sintonizável para encapsulamento de células 3D. Além disso, este protocolo apresenta a metodologia para marcação fluorescente a jusante em microscopia confocal de células encapsuladas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de biomateriais, medicina regenerativa e biologia celular, como a compreensão do papel das interações célula-matriz extracelular em 3D.

A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma plataforma de material reprodutível, ajustável e modular que é passível de estudo de vários tipos de células. No geral, a implementação dessa técnica pode melhorar nossa compreensão dos parâmetros críticos de sinalização da ECM celular que podem ditar o sucesso de futuras terapias regenerativas baseadas em células. Risque uma placa de ágar ampicilina e cloranfenicol com um estoque bacteriano pré-fabricado contendo um vetor que codifica o ELP de interesse.

Em seguida, incube a placa listrada de cabeça para baixo a 37 graus Celsius durante a noite para permitir o crescimento bacteriano. No dia seguinte, pegue uma única colônia da placa e inocule a cultura inicial pré-aquecida. Incube a cultura em uma coqueteleira a 37 graus Celsius por 16 horas.

Após o período de incubação, transferir 20 mililitros da cultura inicial para cada balão de extracção, utilizar uma pipeta serológica. Deixar o balão de expressão a agitar durante uma hora. Após uma hora, medir a densidade óptica a 600 nanómetros de uma alíquota do balão de expressão.

Assim que a leitura atingir 0,6, reduza a temperatura do agitador para 32 graus Celsius. Quando a leitura atingir 0,8, adicione um mililitro de IPTG filtrado estéril de um molar para induzir a expressão de ELP no frasco de expressão. Permita que a cultura se expresse por sete horas.

Após sete horas, centrifugar os meios de expressão a 12 000 x g durante 15 minutos a quatro graus Celsius numa centrifugadora de chão. Após a centrifugação, use uma espátula para coletar o pellet de célula do recipiente da centrífuga e coloque em um saco ziploc pré-pesado. Em seguida, dissolva o pellet celular em tampão TEN filtrado estéril.

Massageie o pellet celular para formar uma solução homogênea. Congele o saco ziploc com pellet de célula ressuspensa em um recipiente secundário a 80 graus Celsius. Ao pellet celular descongelado, adicione aproximadamente 30 a 40 miligramas de desoxirribonuclease e um mililitro de PMSF 100 milimolar para cada 100 mililitros de lisado celular.

Incube o lisado a quatro graus Celsius em uma coqueteleira durante a noite. Após o terceiro ciclo de congelamento e descongelamento, centrifugar as amostras a pelo menos 15.000 x g por uma hora a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, despeje o sobrenadante do recipiente da centrífuga e transfira a solução para um novo recipiente da centrífuga.

Para cada 100 mililitros de sobrenadante, adicione 5,84 gramas de cloreto de sódio em três partes a uma concentração molar final. Incube a suspensão em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação, centrifugar as amostras a pelo menos 15 000 x g durante uma hora a 37 graus Celsius.

Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante do recipiente da centrífuga e massacrar o sedimento. Em seguida, adicione 10 mililitros de água ultrapura autoclavada por grama de pellet obtido após centrifugação. Para garantir que a proteína se dissolva completamente, use uma espátula de metal para amassar e ressuspender o pellet.

Incube o pellet ressuspenso a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador orbital. Repita as etapas de centrifugação a frio e a quente por um total de três ciclos para purificar ainda mais o ELP. Em seguida, dialize o sobrenadante residual em uma membrana de diálise de 3,5 kilodalton contra quatro litros de água ultrapura pré-resfriada a quatro graus Celsius por três dias para dessalinizar a solução proteica.

Centrifugue a solução dialisada final em uma centrífuga pré-resfriada. Congelar o sobrenadante a 80 graus Celsius em um tubo cônico pré-pesado. Finalmente, liofilize a solução congelada por três dias e, em seguida, pese o produto liofilizado final para determinar o rendimento da proteína.

Com a ajuda de um punção de biópsia, faça furos em uma folha de silicone de 0,5 milímetro de espessura. Em seguida, corte um quadrado ao redor de cada buraco. Em seguida, use uma pinça para remover o filme plástico de cada lado dos moldes individuais.

Depois de remover o filme plástico, use a pinça para posicionar o número idêntico de moldes de silicone nus e lamínulas de vidro em fileiras alternadas na tampa de uma placa de 48 poços para posterior colagem de plasma. Depois que todos os materiais de cultura de células tiverem sido fabricados, a preparação do tipo de célula de interesse para o encapsulamento de hidrogel a jusante pode começar. Depois de dissociar as células em uma única suspensão celular, alíquota o número desejado de células em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, centrifugue as células a cerca de 200 x g durante três minutos. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e armazenar o sedimento no gelo. Ressuspenda o pellet celular na solução estoque ELP até 80% do volume final.

Em seguida, use uma pipeta para misturar a solução em uma suspensão homogênea de células em ELP. Para os 20% restantes do volume final, adicione a solução-mãe de THPC à suspensão ELP da célula. Pipete várias vezes para garantir a formação de uma mistura homogênea, evitando a formação de bolhas de ar.

Em seguida, em movimentos circulares, pipete a mistura de THPC ELP da célula em cada molde em uma placa de 24 poços. Em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 minutos. Após 15 minutos, incube as amostras a 37 graus Celsius por mais 15 minutos.

Quando a incubação terminar, adicione cuidadosamente 750 microlitros de meio de cultura de células quentes a cada poço em uma placa de 24 poços. Deixe o hidrogel a 37 graus Celsius pela duração desejada da cultura. Primeiro, aspire o meio de cada poço.

Em seguida, lave os poços com um mililitro de DPBS quente. Após a conclusão da lavagem, adicione 750 microlitros de solução de fixação a cada poço. Em seguida, incube a placa de 24 poços a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após a incubação, aspirar a solução de fixação de cada um dos alvéolos e descartar o fixador em um recipiente de resíduos perigosos. Em seguida, adicione um mililitro de DPBS à amostra e descarte imediatamente o DPBS em um recipiente de resíduos perigosos. Em seguida, adicione 750 microlitros de solução de permeabilização para permeabilizar a amostra por uma hora em temperatura ambiente no balancim a 15 rotações por minuto.

Após uma hora, aspire a solução de permeabilização e adicione 750 microlitros de solução de bloqueio à amostra. Deixe a amostra no balancim em temperatura ambiente por três horas. Em seguida, dilua os anticorpos primários desejados com a solução de diluição de anticorpos.

Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de anticorpos a cada amostra. Incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, aspirar a solução primária de anticorpos e, em seguida, lavar as amostras com PBST durante três horas à temperatura ambiente a 15 rotações por minuto.

Em seguida, dilua os anticorpos secundários apropriados em cinco miligramas por mililitro de solução estoque de DAPI para atingir uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro. Em seguida, adicione 500 microlitros da solução a cada amostra. Em seguida, use papel alumínio para cobrir a placa de 24 poços e incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, aspire a solução de anticorpos secundários e lave as amostras com PBST três vezes cada por 30 minutos em temperatura ambiente em um balancim. Em seguida, posicione uma gota de meio de montagem rígido na superfície de uma lâmina de vidro e coloque a amostra no meio de montagem. Por fim, use esmalte para selar as amostras na lâmina da tampa de vidro para evitar contaminação ou movimento da amostra.

Aqui, a expressão da proteína-alvo com o ELP de comprimento total sob condições controladas é validada pela presença de bandas a 37 kilodaltons em SDS-PAGE e análise de western blot. No entanto, sob condições não controladas, várias bandas de baixo peso molecular também são visíveis usando western blot. As bandas de peso molecular mais baixo correspondem a proteínas com menos de quatro repetições de domínio semelhantes à elastina, indicando que a proteína não é totalmente traduzida durante a expressão.

Esse resultado é comum ao realizar a expressão acima de 32 graus Celsius. Para variar a concentração do ligante adesivo celular, mantendo as propriedades mecânicas do hidrogel constantes, a proporção da variante ELP contendo o adesivo celular derivado da fibronectina e as sequências adesivas não celulares são ajustadas. Além disso, as células progenitoras neurais murinas também são viáveis por um período de sete dias quando encapsuladas em um hidrogel 3%ELP.

As células vivas são identificadas em verde devido à coloração de calceína AM, enquanto o homodímero de etídio vermelho é preferencialmente absorvido pelas células mortas. Para validar o fenótipo de células-tronco de células progenitoras neurais, a expressão de marcadores canônicos como Sox2 e nestina também é visualizada por imunocoloração quando as células são encapsuladas nos hidrogéis 3D ELP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar e purificar a proteína semelhante à elastina para encapsulamento a jusante de vários tipos de células e, além disso, investigar o papel do microambiente 3D na modulação do fenótipo celular.