Experimentos de imunocoloração e penetração de corantes para definir proteínas de junção septata plissada no núcleo em epitélios embrionários de Drosophila

Nossa pesquisa investiga as funções não oclusórias do desenvolvimento das proteínas de junção septática, focando na identificação e caracterização de novos componentes envolvidos na estrutura e nos papéis biológicos. Este protocolo tem como objetivo caracterizar a organização e a função de oclusão das junções do septo plissado nos epitélios ectodérmicos dos embriões de Drosophila. Para começar, cruze moscas Drosophila machos e fêmeas saudáveis com os genótipos apropriados e coloque-as em gaiolas de coleta de embriões com placas frescas de suco de maçã cobertas com pasta de levedura.

Permita que os adultos depositem ovos fertilizados nos pratos de suco de maçã. Retire a placa da gaiola de coleta de ovos e envelheça os embriões por 13 a 16 horas após a postura a 25 graus Celsius para alcançar o estágio 16. Em seguida, fixe os embriões do estágio 16 em uma solução fixadora apropriada e realize a imunocoloração com os anticorpos desejados.

Para melhores resultados, fotografe os embriões em um microscópio confocal com uma objetiva de imersão em óleo de 40x. Após focar no embrião de interesse, ajuste a intensidade e o ganho do laser para alcançar um sinal fluorescente forte sem saturar nenhum pixel. Identifique embriões em estágio 16 que não expressam proteína fluorescente verde codificada pelo balanceador, usando a morfologia do intestino médio.

Foque a varredura na glândula salivar ou intestino posterior e posicione a varredura Z para incluir o maior diâmetro possível do lúmen para visualizar a membrana lateral completa da célula epitelial. Estabeleça uma média linear adequada e imagine um tecido polarizado em pelo menos 20 embriões controle e 20 embriões Cora 4 mutantes estágio 16. Registre dados apenas de embriões nos quais o marcador de junção de adesão está fortemente localizado na região apical-lateral da membrana.

Em embriões selvagens do estágio 16, avalie-se o enriquecimento das proteínas da junção septato plissada ao longo da região apical da membrana lateral, próxima à junção aderente. Registre a distribuição persistente do marcador da junção do septo plissado ao longo de toda a membrana lateral do mutante. Faça uma solução de corante fresca dissolvendo dextrano de 10 kilodalton marcado com rodamina em 1 miligrama por mililitro em fosfato de sódio 0,5 molar a pH 7,5, com 5 milimolares de cloreto de potássio.

Usando um puxador de agulha, puxe um tubo capilar interno de 1 milímetro de diâmetro por 0,5 milímetro de diâmetro interno com fibra, para dentro de uma agulha de vidro. Em seguida, coloque a agulha de vidro no suporte da agulha de um micromanipulador e posicione o micromanipulador ao lado de um microscópio invertido. Oriente a agulha o mais próximo possível do lâmina do microscópio e abaixe-a para o mesmo plano Z do lado da lâmina.

Quebre a ponta da agulha batendo-a contra a lateral da lâmina do microscópio. Levante a agulha acima do nível do ferrolho e remova-a para carregar. Em seguida, encha o tubo capilar com o corante usando a menor ponta de pipeta disponível.

Recarregue a agulha cheia no suporte da agulha. Teste o fluxo do dextrano de 10 kilodalton injetando uma pequena quantidade em uma gota de óleo de halocarbonetos na superfície de uma lâmina de microscópio. Usando uma capa de 22 x 22 milímetros com espessura número 2, crie uma linha recortada em um prato de suco de maçã.

Alinhe aproximadamente 25 embriões cada um do controle e Cora 4 mutante no estágio 16 ou 17 no prato de suco de maçã. Certifique-se de que suas extremidades posteriores estejam alinhadas ao longo da linha e que as superfícies ventrais estejam voltadas para cima. Depois, aplique um pedaço de fita dupla face em uma tampa número 2 de 22 x 22 milímetros.

Toque a fita na linha do embrião e esfregue levemente a capa para transferir os embriões da placa para a fita dupla face. Em seguida, adicione uma gota de óleo de halocarboneto em uma lâmina de microscópio e prenda a lâmina de cobertura permitindo que a ação capilar crie uma ligação. Oriente o deslize da tampa mais próximo do lado do ferrolho oposto a qualquer parte fosca.

Secar os embriões por três a cinco minutos em um recipiente de dessecante e cobrir completamente os embriões com óleo de halocarbono. Monte a lâmina com os embriões no microscópio invertido, com os embriões voltados para cima e afastados do objetivo. Alinhe o micromanipulador de modo que a agulha fique voltada para a extremidade posterior dos embriões em um ângulo o mais próximo possível da paralelidade aos embriões, e ajuste o eixo Z do micromanipulador para que a ponta da agulha se alinhe com o ponto médio do embrião ao longo do eixo dorsal-ventral.

Em seguida, injete os embriões movendo rapidamente o estágio para dentro da agulha, de modo que a ponta da agulha entre no hemocelo. Injete aproximadamente 0,2 a 0,5 nanolitros de corante usando uma seringa de 10-25 ou 50 mililitros. Retire rapidamente a agulha e mova o estágio para o próximo embrião para a injeção do corante.

Depois, adicione óleo de halocarbonetos adicional sobre os embriões. Cubra os embriões com um engobe de cobertura número 2 de 22 x 22 milímetros para criar uma camada uniforme de óleo entre os deslizamentos e evitar esmagamento. Realize imagens em um microscópio composto fluorescente ou confocal após a injeção de corante dextrano.

No microscópio confocal, adquira uma pilha Z através de aproximadamente um quarto da profundidade do embrião ao longo do eixo dorsal-ventral para avaliar o lúmen da traqueia. Examine o lúmen da traqueia, uma glândula salivar ou intestino posterior para acúmulo de dextrano marcado. Registre o genótipo e o estágio de desenvolvimento de cada embrião e se o dextrano marcado se se acumula em algum órgão tubular.

Note embriões em que o espaço perivitelino é fortemente corado com corante, pois estes podem representar injeção inadvertida nesse espaço. Em embriões do tipo selvagem, o complemento relacionado à macroglobulina, ou Mcr, foi uniformmente localizado ao longo da membrana lateral no estágio 13, enriqueceu-se na região apical da membrana lateral no estágio 14 e foi fortemente localizado na região apical-lateral, apenas basal à junção do aderente no estágio 16. A coloração cortical por anticorpos definiu as junções septais plissadas maduras em embriões selvagens do estágio 16, de forma semelhante à Mcr.

Nos embriões mutantes de Cora 4, o Mcr não conseguiu localizar forte apical no estágio 16 e permaneceu distribuído ao longo da membrana lateral. A localização da E-cadherina foi semelhante em embriões do tipo selvagem e do mutante Cora 4, estágio 16. Em embriões do tipo selvagem estágio 17 injetados com dextran de 10 kilodalton marcado com rodamina, o corante envolveu a traqueia, mas não penetrou o lúmen.

Nos embriões do mutante Cora 4 estágio 17, o contraste se acumulou no lúmen da traqueia dentro de 10 minutos após a injeção. Esse protocolo permite aos pesquisadores determinar com confiança se um gene codifica o núcleo ou o componente acessório das junções do septo plissado nos tecidos embrionários da Drosophila. O estadiamento embrionário é absolutamente crucial durante a execução dessa técnica, pois requer embriões no estágio 16.

As junções septadas amadurecem ao longo do tempo até se estabelecerem totalmente no estágio 16. Acreditamos que esse protocolo pode ser implementado de forma eficaz em triagem genética aberta usando linhas de interferência de RNA para identificar novos genes de junção de septato plissado.