Name: Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a quantificar a ativação de PARP1/PARP2 em células mamíferas usando um repórter de fusão PBD-EGFP. Este método permite análise em tempo real de focos de PAR induzidos por genotoxinas sem lise celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>Reagentes, produtos químicos e peptídeos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros Durapore steriflip de 0,45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio 20 x 20 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de cultura celular, 100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de cultura celular, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular de 6 poços</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Crioviais de 2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>Dietil éter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfóxido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtros estéreis descartáveis, 0,45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico, 200 provas</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino inativado por calor</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas Kim Wipes grandes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Kit Lenti-X GoStix Plus</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl) tetrahydrofuran-2-yl]-4H-pyridine-3-carboxamida)</td><td>Marie Migaud ou NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de PARG (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de PARPi (Veliparib, ABT-888)</td><td>MedChemExpress</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (Reagente de transfecção)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) meio de montagem anti-fade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>Linhas celulares&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(Derivada de células renais embrionárias humanas transformadas com o antigênio grande T do SV40)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428&nbsp;</td><td>Presente gentil de</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(Linha celular de tumor de glioblastoma humano)</td><td>Dr. Ian Pollack (Universidade de Pittsburgh)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(Células epiteliais de pigmento da retina humana imortalizadas com hTERT)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(Linha celular de osteossarcoma humano)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>DNA recombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Estoque do laboratório# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Estoque do laboratório# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Estoque do laboratório# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR é o domínio WWE de RNF146, resíduos de aminoácidos 100-182, fundidos a EGFP; contém um cassete de resistência a Higromicina)</td><td>Estoque do laboratório# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063</td><td></td></tr><tr><td>Software e algoritmos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (para preparação de figuras)</td><td>Adobe Systems</td><td>Versão 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Versão 10.5.0 (Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização e análise quantitativa da ativação de parp1/parp2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

visualization-quantitative-analysis-genotoxin-induced-parp1parp2

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método para monitorizar a actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas é descrito. A degron-GFP-desestabilizado (GFP-dgn) e uma proteína de fusão GFP estável dgnFS-são gerados e transduzidos para a célula utilizando um vector de expressão lentiviral. Esta técnica permite a geração de um estábulo GFP-dgn/GFP-dgnFS linha celular que expressa em que a actividade de ubiquitina-proteassoma podem ser facilmente avaliados utilizando epifluorescência ou citometria de fluxo.

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

A actividade citotóxica do fenantridina PJ-34 em células de cancro sujeitos a mitose foi documentada em tempo real por meio de imagem confocal vivo. PJ-34 erradicou o câncer de mama humano MDA-MB-231 células abrigam extra-centrossomas na mitose. Ao contrário de mitose bi-focal normal, o Extra-centrossomas não foram agrupados nos dois pólos do fuso na presença de PJ-34.

A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Este artigo descreve os protocolos para avaliar o efeito de proteínas fluorescentes na agregação e toxicidade de misfolded polyglutamine expansão para a avaliação rápida de uma proteína fluorescente recentemente descaracterizada no contexto dos repórteres fluorescentes.

Efeito de proteínas fluorescentes na fusão parceiros usando Polyglutamine ensaios de toxicidade em levedura

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Neste estudo, apresentamos um ensaio celular in vitro para identificação de produtos químicos teratogênicos. A dinâmica da sinalização do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)/fator de resposta sérica (SRF) foi medida em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS), e o risco de teratogenicidade foi avaliado quantificando a interrupção química dessa via de sinalização.<br...

Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Aprenda a quantificar a ativação de PARP1/PARP2 em células mamíferas usando um repórter de fusão PBD-EGFP. Este método permite análise em tempo real de focos de PAR induzidos por genotoxinas sem lise celular.

Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente

Explorar mais vídeos