Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente

Nosso laboratório estuda as vias de reparo do DNA dependentes de PARP1 e PARP2 e resposta ao dano ao DNA em células normais e transformadas. Um desafio no campo é a análise quantitativa da ativação de PARP1 e PARP2 em células, evitando a lise celular. Isso permite estudos de localização subcelular.

Para começar, adicione 375 microlitros de soro bovino fetal e DMEM livre de Penicilina-Estreptomicina a um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Depois, adicione 10 microlitros de um reagente de transfecção à base de lipídios e todos os plasmídeos necessários ao tubo. Toque suavemente o tubo de microcentrífuga para misturar o meio, o reagente de transfecção e o DNA plasmídico.

Incube em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos para permitir a formação de DNA e complexo de reagentes de transfecção. Em seguida, adicione o plasmídeo e a mistura de reagentes de transfecção gota a gota ao recipiente de 60 milímetros contendo as células cultivadas de 293FT sem remover o meio, e retorne as células à incubadora por 48 horas. Em seguida, colete o meio de cultivo das células transfectadas de 293FT.

Para isolar as partículas de lentivírus, filtre-se o meio coletado através de um filtro estéril de 0,45 micrômetro para separar os detritos celulares das partículas lentivirais. Para a transdução, cultive as células desejadas por 24 horas e verifique se a confluência celular está entre 20% e 40%. Em seguida, adicione um mililitro de vírus, um mililitro de meio de crescimento e dois microlitros de Polybrene em um tubo cônico de 15 mililitros, misturado suavemente por inversão. Agora, remova o meio de crescimento da placa de seis poços.

Adicione a mistura de vírus, médio e Polybrene em cada poço. Coloque as células com a mistura de transdução em uma incubadora contendo uma atmosfera umidificada a 32 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 16 a 18 horas. Para validar a expressão dos aminoácidos RNF146, de 100 a 182 EGFP, semente 200.000 células expressas de LivePAR por prato de cultura contendo placas de cobertura.

Deixe as células de 24 a 36 horas aderirem às lâminas de cobertura, condicione o meio e comece a se replicar. Em seguida, expõe as células que expressam LivePAR aos reagentes fornecidos. Adicione os compostos diretamente ao meio que contém as células na cobertura e gire suavemente o meio nos recipientes de cultura celular para distribuir os compostos.

Incube os pratos de 60 milímetros a 37 graus Celsius por 60 a 90 minutos. Para fixar as células, remova o meio e lave as células com PBS. Prefixe as células com 4% de formaldeído em PBS por 15 minutos à temperatura ambiente.

Após remover o formaldeído, lave as células três vezes com PBS. Depois, adicione três mililitros de metanol frio e acetona às células em uma proporção de 7:3 para fixá-las. Coloque os pratos a menos 20 graus Celsius por nove minutos.

Depois, remova a solução de metanol acetona. Após lavar as células três vezes com PBS, pipete 15 microlitros de meio antifade contendo DAPI em uma lâmina de vidro. Monte suavemente a tampa e deslize sobre o meio de montagem com as células voltadas para dentro, minimizando as bolhas.

Centralize e fixe a tampa no ferrolho de vidro e fele as laterais aplicando uma pequena quantidade de esmalte transparente de prego nas bordas. Coloque os slides no escuro para deixar o esmalte das unhas secar. Após baixar e instalar a Imagem J, abra a Imagem J e instale o arquivo de texto macro LivePAR_Macro clicando em Plugins, selecionando Macros e escolhendo Instalar.

Abra todos os arquivos confocais na Imagem J e salve os arquivos como arquivos TIFF para preservar os arquivos originais. Depois, abra uma planilha e salve como Date_CellLineFociAnalysis. Analise um arquivo TIFF de cada vez.

Pressione 1 para encontrar os núcleos. Quando a janela do gerenciador de ROI se abrir, selecione todas as entradas e pressione adicionar para sobrepor a área do núcleo sobre a imagem original. Exclua núcleos identificados incorretamente e exclua núcleos que não estejam totalmente dentro do referencial.

Depois, desenhe o núcleo usando a ferramenta de Seleção à Mão Voja e pressione 2 para quantificar os focos do PAR. Selecione cada núcleo no gerenciador de ROI e conte o número de focos por núcleo. Copie e cole os dados quantificados no documento aberto da planilha após marcar todos os núcleos do arquivo.

Da mesma forma, repita a análise para todos os arquivos TIFF. Quando terminar, plote focos PAR por núcleo no software escolhido. As células de controle do veículo mostraram coloração pancelular com EGFP.

As células tratadas com genotoxina apresentaram acúmulo de focos nucleares representando localização dentro do núcleo. O pré-tratamento com os inibidores de PARP1 e PARP2 veliparib resultou na perda dos focos de PAR. A quantificação do número de focos de PAR por núcleo em função do tempo e das condições de tratamento mostrou resultados semelhantes.

Esse protocolo nos permite quantificar a ativação dos eixos de sinalização PARP1 e PARP2 em resposta a genotoxinas e após alterações genéticas. Empregamos técnicas tradicionais de imunofluorescência com este ensaio para validar a colocalização de proteínas com poli ADP-ribose. Daqui para frente, estamos utilizando esse ensaio para testes de genotoxicidade para análise de alta taxa de PARP1, PARP2 ou inibidores de PARP, e para identificar novos fatores envolvidos na sinalização de PARP1 e PARP2.