Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

O objetivo geral desta metodologia é visualizar um dos primeiros passos na ativação de um iniciador de caspases. Essa etapa é chamada de proximidade induzida e ocorre quando as moléculas de caspase se juntam para formar dímeros ativos durante a morte celular por apoptose. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da caspase, como quando, onde e com que eficiência as caspases iniciadoras específicas podem ser ativadas.

A principal vantagem dessa técnica é que é possível visualizar a montagem de complexos de ativação de caspases em células vivas em tempo real. Este método de complementação de fluorescência biomolecular usa fragmentos da proteína tiroxina, Vênus, que foram infundidos em uma caspase. Os fragmentos não são fluorescentes por conta própria, mas quando a caspase sofre proximidade induzida, isso une as duas metades de Vênus e elas se acendem.

Para transfectar as células, primeiro adicione 12 microlitros do reagente de transfecção a 750 microlitros de meio de soro reduzido em um tubo estéril. Incube a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 10 nanogramas de um plasmídeo repórter a um tubo de esteril de 1,5 mililitro para cada poço a ser transfectado.

Adicione 20 nanogramas de cada plasma de caspase BiFC a cada tubo. Aumente cada tubo até um volume total de 100 microlitros adicionando meio de soro reduzido. Usando uma pipeta P200, adicione 100 microlitros de solução reagente de transfecção à mistura de plasmídeo de maneira gota a gota.

Depois de incubar a mistura de reagentes de transfecção de plasmídeo por 20 minutos à temperatura ambiente, aspirar o meio das células usando uma pipeta ou com sucção. Em seguida, usando uma pipeta P1000, pipete 800 microlitros de meio sem soro suavemente na lateral do poço. Usando uma pipeta P200, adicione 200 microlitros do complexo lipídico DNA gota a gota a cada poço.

Incube as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação, remover os meios isentos de soro que contêm os complexos lipídicos de ADN por aspiração por sucção ou com a pipeta, tomando cuidado para não romper a monocamada. Pipete dois mililitros de meio de crescimento completo pré-aquecido suavemente na lateral de cada poço antes de incubar as células, conforme descrito no protocolo de texto.

Antes da aquisição dos dados, realize a indução da ativação da caspase conforme descrito no protocolo de texto. Ligue o microscópio seguindo as instruções do fabricante e inicie o software de aquisição. Selecione a objetiva de óleo 60x ou 63x e coloque uma gota de óleo na objetiva.

Em seguida, coloque a placa de cultura no microscópio stage usando o suporte de placa correto. Ligue o aquecedor e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Concentre-se na fluorescência do repórter usando o laser ou filtro RFP.

Insira a porcentagem de potência do laser em 50% e o tempo de exposição em 100 milissegundos para Vênus e RFP como ponto de partida para determinar as configurações ideais a serem usadas para o experimento. Ative a captura ao vivo e inspecione a imagem resultante e os histogramas exibidos para ambos os canais. Se o sinal estiver baixo e a imagem for difícil de distinguir, aumente a porcentagem de potência do laser e/ou o tempo de exposição em incrementos até que o sinal e a imagem pareçam bons.

Em seguida, selecione ou abra o módulo de pilha Z no software do microscópio. Ajuste o foco em uma direção até que a célula não esteja mais visível. Selecione esta como a posição superior.

Ajuste o foco na direção oposta até que a célula não fique mais visível novamente e selecione-a como a posição inferior. Escolha o tamanho ideal da etapa e inicie a aquisição. Se necessário, ajuste o histograma do visor para melhorar a aparência visual do sinal fluorescente.

Por fim, use um software de renderização tridimensional para reconstruir a imagem 3D. Se uma fonte de dióxido de carbono estiver disponível, coloque o dispositivo de fornecimento de dióxido de carbono em cima do suporte da placa. Defina o nível de dióxido de carbono para 5% e ligue o controlador de dióxido de carbono de dentro do software.

Navegue até um campo de células transfectadas. Visualize a imagem ao vivo das células adquirida pela câmera e exibida pelo software de aquisição na tela do computador usando o laser RFP. Em seguida, insira as configurações de porcentagem de potência do laser e tempo de exposição para o laser RFP.

Em seguida, insira a configuração para porcentagemtage potência do laser e tempo de exposição para a luz laser YFP. Para cada poço da placa, escolha várias posições diferentes que contenham uma ou mais células que expressem o repórter. Insira o intervalo de tempo entre cada quadro das voltas de tempo e o número total de quadros a serem tirados.

Revisite cada posição e corrija e atualize o foco conforme necessário. Comece o lapso de tempo e salve os dados. Por fim, analise os dados usando o software de imagem disponível, conforme descrito no protocolo de texto.

Aqui é mostrado um exemplo de caspase-2 BiFC após danos ao DNA. As células foram tratadas com um inibidor da topoisomerase um: Camptotecina. A proteína fluorescente vermelha, mCherry, foi usada como repórter para mostrar que as células expressam a sonda BiFC e ajudam a visualizar o número total de células.

A fluorescência de Vênus é mostrada em verde e os grandes pontos representam a proximidade induzida pela caspase-2. Para fornecer visualização de alta resolução da localização subcelular do complexo de ativação da caspase, células individuais podem ser visualizadas em três dimensões. A ativação da caspase-2 é mostrada aqui em verde e o núcleo é mostrado em vermelho.

A visualização de fatias ortogonais da célula é mostrada onde o plano xy, o plano yz e o plano xz podem ser visualizados lado a lado. A imagem tridimensional também pode ser exibida em um filme em que a célula é girada em torno do eixo y. Para fornecer dados cinéticos da caspase, a imagem de lapso de tempo BiFC pode ser usada.

Este filme mostra a ativação da caspase-2 em verde após o tratamento com o inibidor de proteassoma: Bortezomibe. As mitocôndrias são mostradas em vermelho. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a caspase BiFC para rastrear a montagem dos complexos de ativação da caspase em tempo real e determinar distintamente o tamanho, a forma e a localização dos complexos produzidos.

Este protocolo descreve algumas abordagens baseadas em microscópio para coletar os resultados do experimento caspase BiFC; No entanto, deve-se notar que várias variações e combinações dessas abordagens podem ser usadas para interrogar criativamente as vias de ativação da caspase. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir controles de artefatos induzidos por microscopia, como fototoxicidade e fotobranqueamento. O protocolo de texto que acompanha inclui dicas para fazer isso.

A decisão de qual método de aquisição e análise usar será determinada pelos perímetros a serem explorados e pela disponibilidade de instrumentação e software de imagem. Seguindo este procedimento, abordagens de análise de imagem podem ser usadas para interpretar os dados. Você pode medir as mudanças na intensidade da fluorescência ao longo do tempo ou a porcentagem de células fluorescentes.

O número de focos ou o tamanho do objeto também podem ser calculados.