Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

Esta demonstração usa imagens de células vivas de duas e 3D para entender as relações espaço-temporais das proteínas envolvidas na resposta ao dano do DNA. Primeiro, transfecte ou transduza sua linha celular de escolha com construções de expressão contendo marcadores fluorescentes apropriados. Aqui, M Cherry e GFP adquirem uma série de vídeos de controle mostrando as células marcadas com fluorescência em condições normais.

Em seguida, aplique um tratamento apropriado e capture dados dos efeitos do tratamento no processo de células fluorescentes e analise os dados de vídeo para relações espaço-temporais de proteínas. Em última análise, a microscopia de fluorescência de células vivas pode detalhar a dinâmica celular, como a formação de focos de 53 BP um em resposta a agentes prejudiciais ao DNA ou o comportamento de 53 BP durante a mitose. Começamos a nos interessar por imagens de estilo de vida em dois e 3D quando queríamos estudar como os tratamentos variados afetavam a mitose em certas linhagens celulares.

Esta abordagem experimental nos permite estudar a resposta ao dano ao DNA e a manutenção da estabilidade genômica mais facilmente do que os métodos tradicionais. Além disso, você pode usar esse método para estudar como certas proteínas interagem em várias vias de sinalização e várias linhagens celulares. A principal vantagem da imagem de estilo de vida em relação às técnicas tradicionais, como a citoquímica, é que ela permite o estudo das proteínas de resposta a danos no DNA em tempo real.

Otimizar as condições de gravação corretas pode ser um desafio. Esta demonstração pode ser usada para ver os muitos pequenos passos necessários para garantir o sucesso. Lembre-se de que a persistência compensa quando se trata de minimizar o branqueamento de fotos, encontrar os intervalos de gravação corretos e a duração certa da gravação, etc.

Transfectar ou transduzir as linhagens celulares apropriadas com os plasmídeos para a expressão das proteínas de fusão mCherry e GFP. Manter as culturas sob seleção de medicamentos e verificar periodicamente a expressão das proteínas fluorescentes no dia anterior à aquisição da imagem. Colha as células usando tripsina.

Em seguida, semeie culturas de baixa densidade em placas de fundo de vidro de 3,5 centímetros. Este protocolo foi desenvolvido usando o microscópio confocal de disco giratório Zeiss cell observer SD, equipado com um axio observer Z one stand Primeiro, verifique se o gás CO2 está correndo para o módulo CO2 do sistema de incubação. Se o microscópio for suportado por uma mesa de ar antivibração, ligue o suprimento de ar para a mesa de ar.

Agora ligue a energia das câmeras da unidade de disco giratório do suporte do microscópio, módulos de incubação, iluminador HXP, platina motorizada, laser de argônio e computador. Ligue os interruptores das linhas de laser a serem usadas. Inicie o software de visão Axio.

O software Avision pode ser personalizado com janelas e menus suspensos específicos do microscópio e dos componentes que ele controla. Como tal, cada interface do usuário tem uma aparência potencialmente única Aproximadamente uma hora antes da imagem. Localize os controles da incubadora e ligue o aquecimento da câmara superior e da placa do palco.

Defina a temperatura para 37 graus Celsius. Ligue o controle de CO2 e defina o nível em 5%Selecione a lente objetiva para imagem Neste estudo. A lente objetiva requer o uso de um meio de imersão que tenha um índice de refração semelhante ao da água.

Se você precisar criar imagens de várias posições por longos períodos de tempo, certifique-se de aplicar meio de imersão suficiente para que o osciloscópio não seque. Coloque a placa de cultura no palco e coloque a lente objetiva em contato com a parte inferior, usando os controles do microscópio ou o software. Direcione a luz emitida para as oculares e selecione o conjunto de filtros de campo amplo apropriado para o sinal fluorescente de interesse.

Agora veja através das lentes oculares. Focalize a imagem e localize um campo adequado de células usando o software ou os controles do microscópio. Direcione a luz emitida para longe das oculares para a porta com a unidade de disco giratório confocal no software.

Ligue o laser apropriado para este estudo. Para cada canal, ajuste a intensidade do laser ajustando o controle do filtro sintonizável óptico kuo para um nível apropriado. Em seguida, selecione o espelho dicróico e os filtros de emissão apropriados.

Abra o obturador da unidade do disco giratório. Agora selecione a janela ao vivo para exibir o campo de visão atual. Agora abra a janela de controle da câmera.

Selecione a câmera a ser usada e defina o tempo de exposição para aproximadamente 100 milissegundos. Ajuste a porcentagem e o ganho EM conforme necessário. Além disso, abra o controle da unidade de disco giratório confocal e ajuste a velocidade do disco giratório inserindo o tempo de exposição da câmera que foi definido para capturar uma imagem adequada.

Clique em definir para bloquear a alteração. Agora abra a janela de aquisição multidimensional. Selecione a guia de canal e carregue ou selecione os canais apropriados definidos para o Flora Fours.

Para garantir o registro da imagem, use um espelho dicróico comum para ambos os canais. Defina o software para foco automático. Prossiga para a janela MDA e clique na guia ZS stack.

Selecione a pilha ZS na posição de foco atual. Defina o intervalo para um Zack de 10 mícrons e escolha o ideal para o número de etapas para garantir a amostragem de nyquist por meio de Z.Agora clique em iniciar e analise a imagem da pilha Z resultante. Selecione a guia de tempo.

Defina o intervalo entre os pontos de tempo da imagem e a duração geral da sessão. Para imagens multiponto de várias células na antena, abra a janela MDA. Selecione a guia de posição e verifique se a configuração de aplicação antes ou depois do ponto de tempo por posição está marcada.

Agora selecione marcar. Encontre usando a visualização ao vivo, mova a antena parabólica e selecione os campos de visão apropriados. Clique em iniciar no menu de aquisição multidimensional para iniciar o experimento e gravar um vídeo de controle.

Prossiga para adicionar o tratamento apropriado e grave o vídeo experimental em intervalos de tempo determinados por um período de tempo definido. Para esta linhagem celular e para monitorar todo o processo de mitose, usamos um intervalo de sete minutos e meio e de quatro a cinco horas. Você terá que determinar as configurações específicas para sua linha celular e para o que deseja estudar.

Abra o software de velocidade, crie e nomeie uma nova biblioteca e importe os arquivos de vídeo experimentais para visualizar os arquivos. Tente usar a configuração de foco estendido, ajuste os vídeos conforme necessário. O Velocity está equipado com uma variedade de ferramentas para ajudar a melhorar a qualidade de suas imagens adquiridas.

Se as configurações do microscópio forem apropriadas, isso economizará muito tempo mais tarde na edição. Muitas vezes, é útil devolver suas imagens e ajustar o brilho e o contraste, suas necessidades específicas variam de acordo com seu experimento Para visualizar as células em 3D. Alterne para a configuração de opacidade 3D.

Isso permite a rotação das células renderizadas em 3D no espaço, fornecendo assim múltiplas perspectivas de estruturas de interesse dentro das células. Filmes. As imagens estáticas podem ser exportadas para uma variedade de tipos de arquivo com base na preferência do usuário em comparação com os controles. As células de fibroblastos expostas ao CPT formaram focos dentro de cinco a 10 minutos e mantiveram esses focos durante toda a gravação.

Curiosamente, em células renais embrionárias humanas, 53 BP se dissocia da cromatina no início da mitose, formando uma fina névoa ao redor dos cromossomos em condensação. À medida que o teleph ocorre e a mitose chega ao fim, 53 AP um, mais uma vez se agrega em focos distintos. Esperamos que este vídeo permita que você estude as relações espaço-temporais das proteínas envolvidas na resposta ao dano do DNA, bem como outras vias.

Por exemplo, no campo da dinâmica da cromatina, essa técnica foi usada para estudar como a ligação de 53 BP afeta o movimento das extremidades teloméricas do DNA. Após a criação de células geneticamente modificadas, imagens de células vivas de duas e 3D podem ser realizadas em aproximadamente quatro a oito horas. Certifique-se de que as configurações do microscópio estejam ajustadas adequadamente para obter uma imagem ideal.