Name: Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a visualizar proteínas de resposta a danos no DNA em células vivas usando imagens 2D e 3D. Este método permite analisar a dinâmica espacial e temporal de proteínas como 53BP1 durante a mitose.

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Suportado em parte pela R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia foi realizada no VCU - Departamento de Neurobiologia e Anatomia Facilidade Microscopia, suportado, em parte, com recursos do NIH-NINDS Centro núcleo concessão 5P30NS047463. O microscópio confocal disco giratório foi comprado com um prêmio NIH-NCRR (1S10RR027957).

A. Preparação celular <ol><li> Fibroblastos humanos normais primárias (GM02270) foram obtidos a partir do Repositório Coriell Cell, Camden, New Jersey, e imortalizadas com hTERT 6. As células foram cultivadas e expandidas em CellStar 6 cm de pratos no meio (4 ml) que consistem em MEM suplementado com 20% soro fetal bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sódio, e penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> Rim embrionário humano 293 (HEK293) as células foram obtidas a partir de American Type Culture Collection e cultivadas e expandidas em CellStar 6 centímetros-pratos. As células foram mantidas em meios de comunicação (4 ml), constituído por DMEM suplementado com 10% soro fetal de bovino, não-aminoácidos essenciais, L-glutamina e penicilina / estreptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plasmídeo 19836) e H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene 17735 plasmídeo) construções de gene de fusão também expressar genes de resistência à puromicina ou G418, respectivamente, foram transduzidas (fibroblasts) ou transfectadas (HEK293) usando SuperFect (Qiagene) em células e mantidas sob selecção de droga. Manutenção de fluorescência foi verificada periodicamente. </li><li> 24-48 h antes de aquisição de imagem, as células foram tripsinizadas para uma suspensão de célula única e semeadas a uma densidade baixa em 3,5 cm de placas de fundo FluroDish vidro. </li></ol> B. Configuração Microscópio e Aquisição de Imagens Este protocolo foi desenvolvido utilizando o celular Zeiss Observer SD microscópio confocal disco giratório equipado com um Z1 AxioObserver stand, um dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 unidade de disco giratório, 2 Fotometria QuantEM câmeras 512SC EMCCD, um HXP iluminador à base de fibra 120C, 4 lasers (um Lasos 100mW multi-linha Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo de 405 nm, 40 mW diodo nm 561, e 30 mW diodo 635 nm), AOTF, um Pecon XL multiS1 sistema de incubação fase, a incubação Zeiss módulos (O 2 Módulo de S, CO 2 Módulo de S, S TempModule, Aquecimento Unidade XL S) e uma mo Antestorized estágio XY com uma inserção NanoScanZ Z piezo. Para minimizar a aberração esférica, enquanto as células vivas de imagem suportado num meio aquoso, um C-Apochromat 63x/1.20 água / objetivo Corr lente e Immersol Zeiss fluido de imersão W (com um índice de refracção n = 1,334) foram usados. Para 2 canais confocal imaging, um RQFT 405/488/568/647 espelho dicróico e BP525/50 (verde) e BP629/62 (vermelho) filtros de emissão foram utilizados. O software do sistema utilizado foi Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) com AV4 Multi-channel/Z/T, Imaging rápido, Fisiologia, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, câmera dupla, Inside 4D, foco automático e os módulos 3-D Deconvolução. <ol><li> Certifique-se de que o gás de CO 2 está em execução para o Módulo 2 CO do sistema de incubação. Se o microscópio é suportado por uma mesa de ar anti-vibração, ligar o fornecimento de ar (ou gás de N 2) para a mesa de ar. </li><li> Ligue a energia para o stand microscópio, unidade de disco giratório, câmeras, módulos de incubação, iluminador HXP, palco motorizado, Argonlaser, e do computador. </li><li> Depois de um minuto de tempo de aquecimento, desligue a chave de ignição para o laser de argônio para &quot;On&quot;. </li><li> No painel de controle Zeiss laser, ligue os interruptores para as linhas de laser a ser utilizado. </li><li> Comutar o interruptor para o controlador Lasos laser de Árgon de &quot;espera&quot; para &quot;run laser&quot; e ajustar o controlador de luz para o nível óptimo (isto é, logo abaixo do ponto em que o indicador verde passa a vermelho). </li><li> Iniciar o software AxioVision Nota:. Interface do usuário para AxioVision pode ser personalizado com janelas e menus suspensos que são específicos para o microscópio especial e componentes que ele controla. Como tal, cada um dos sistemas tem uma interface potencialmente único. Portanto, instruções genéricas para manipulação de software são fornecidos em etapas subseqüentes, em vez de instruções para janelas de software específicos, guias e / ou menus suspensos. </li><li> Cerca de 1 h antes da imagiologia, no software, localizar os controles para a incubadora eligar o aquecimento para a câmara superior e a placa de fase. Definir a temperatura a 37 ° C. Ligue o controle de CO 2 e definir o nível de 5%. </li><li> Selecione a lente objetiva para imagens. Neste estudo, um 63x/1.20 NA C-Apochromat Água / Corr lente objectiva utilizada foi Nota:. Para esta lente, um meio de imersão com um índice de refracção semelhante ao da água (Zeiss Immersol fluido de imersão W) é necessária. </li><li> Se várias posições separadas devem ser sujeitos a amostragem durante um longo período de tempo, ser determinada a aplicar uma quantidade suficiente de meio de imersão para assegurar que é feita a partir de uma posição para outra. </li><li> Coloque o recipiente sobre o palco e trazer a lente objectiva para cima em contacto com o fundo. </li><li> Usando os controles do microscópio ou o software, direcionar a luz emitida para as oculares e selecionar o apropriado Widefield filtro definido para o sinal fluorescente de interesse (para este estudo, &quot;Red&quot; do filtro de 53BP1 e um &quot;GFP&quot; do filtro de H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Ver através das lentes oculares, focar a imagem, e localizar um campo adequado de células. </li><li> Usando o software ou os controles do microscópio, direcionar a luz emitida longe das oculares para a porta com a unidade de disco confocal spinning. </li><li> No software, ligar o laser apropriado (para este estudo, o laser nm 561 para 53BP1 ea linha 488 nm do laser de árgon durante H2B). </li><li> Para cada canal, ajustar a intensidade do laser, ajustando a acústico-óptico sintonizável filtro de controlo (AOTF) para um nível apropriado. </li><li> Selecione o espelho apropriado dicróico (RQFT 405/488/568/647) e filtros de emissão (PA 629/62 para 53BP1 e BP 525/50 para H2B). Abrir o obturador para a unidade de disco giratório. </li><li> Selecione a janela &quot;Live&quot; para exibir o campo de vista atual. </li><li> No software, abra a &quot;Câmara&quot; de controle, selecione a câmera para ser usada (se um sistema de câmera dupla) e definir o tempo de exposição para aproximadamente 100 ms. Ajuste o% e EM ganhar como neNota cessário:. A construção 53BP1-mCherry parece um pouco fraca. Descobrimos que é útil para aumentar o ganho de EM. </li><li> No software, abra o controlo para a unidade de disco giratório confocal e ajustar a velocidade de rotação do disco, inserindo o tempo de exposição da câmara que foi definida para captar uma imagem adequada (por exemplo, ~ 100 ms). Clique em &quot;Set&quot; para travar a mudança. </li><li> Abra &quot;aquisição multi-dimensional&quot;. Selecione a guia de canais e carregar / selecionar os canais apropriados. Para este estudo, estamos usando canais definidos para DsRed (561 nm excitação laser e BP 629/62 filtro de emissão) e GFP (488 nm linha de laser para excitação e BP525/50 filtro para emissão). </li><li> Para assegurar o registo de imagem, um espelho dicróico comum (RQFT 405/488/568/647) foi utilizado para ambos os canais. Ajustar o software para &quot;Foco automático&quot; Nota:. Vá em Ferramentas → Configurações editor para ajustar as configurações do MDA. Garantir que a energia do laser adequado é definido (&quot;potência do laser Adequada&quot; refere-se a uma configuração que permite que vocêpara excitar o fluoróforo adequado, minimizando foto-branqueamento). </li><li> Na janela MDA, selecione a guia z-stack. Selecione &quot;Z-stack na posição atual foco&quot;. Defina o intervalo de 10 m ~ z-stack e escolher &quot;ótima&quot; para o número de etapas para garantir amostragem de Nyquist através Z. Nota: O tamanho exato do z-stack dependerá da altura de suas células. Ajustar em conformidade. </li><li> 23. Clique em &quot;Iniciar&quot; e analisar a imagem resultante z-stack para garantir as configurações são adequadas para o que você está investigando (por exemplo, neste estudo, foi importante para a imagem de todo o núcleo). </li><li> Selecione a opção &quot;T&quot; (tempo) guia. Para a nossa experiência com a camptotecina, definimos o intervalo entre pontos de tempo de imagiologia de 5 minutos e a duração total da sessão durante 1 hora para um controlo (não tratadas células) de vídeo Nota:. Minimizar foto-branqueamento das células, o experimento devem ser configurados de tal forma que o AOTF blanks o laser entre pontos de tempo de imagem. </li><li> Fou multi-ponto de imagem de várias células no prato, na janela do MDA, selecione a guia posição. Garantir &quot;Aplicar&quot; ajuste antes / depois ponto de tempo &#39;por posição &quot;está marcada. Selecione &quot;Mark_Find&quot;. Usando a visão &quot;Live&quot;, mova o prato ao redor e selecionar campos apropriados do ponto de vista. </li><li> Clique em &quot;Iniciar&quot; no menu de multi-dimensional-aquisição para começar a experimentar e gravar um vídeo de controle (de células não tratadas). </li><li> Após o controlo de vídeo, adicione o tratamento adequado (neste caso, 10 camptotecina uM). Nós gravamos o vídeo (droga células tratadas) experimental em intervalos de 5-10 min para 2-4 horas Nota:. Uma questão importante a considerar é a velocidade com que um dado efeito ocorre após o tratamento. Como visto no vídeo, 53BP1 focos começam a partir de ~ 5 min após a adição de CPT. Apesar de ser um processo relativamente fácil, a adição de drogas ao prato manualmente e re-calibrar o microscópio não ter tempo. Consideração deve ser dada a este ao projetar experimentos. </li><li> Para monitorar mitosis, definimos o intervalo de 7,5 min e registados durante 4-5 h (as configurações específicas dependem da linha celular utilizada e o comprimento do seu ciclo celular). Ajustamentos podem ter de ser tomadas medidas para evitar foto-branqueamento durante gravações mais longas. </li></ol> C. Processamento e Análise de Imagem Este protocolo foi desenvolvido usando o software Volocity (PerkinElmer). O software utilizado para adquirir estes dados (AxioVision) também tem a capacidade de processar e analisar imagens. Usuários são encorajados a utilizar o software disponível para eles, e consultar literatura apropriada quanto à sua aplicação. <ol><li> Abra o software Volocity. Criar e nomear uma nova biblioteca, e importar os arquivos de vídeo. </li><li> Para visualizar os arquivos, que geralmente encontrá-lo mais útil usar o &quot;Extended Foco&quot; configuração. Este sobrepõe as fatias z-pilha e, por este protocolo, permite visualizar focos 53BP1 em diferentes áreas do núcleo. </li><li> Ajuste vídeos, se necessário. Volocity está equipado com uma variedade de ferramentas para melhorar a qualidade das imagens obtidas. Ao garantir que as definições sobre o microscópio foram adequadas, muito tempo pode ser guardado na edição mais tarde. Muitas vezes, é útil para deconvolve suas imagens, e ajustar o brilho / contraste. Suas necessidades de edição específicos irão variar com base na experiência. </li><li> Adicionar um carimbo de tempo relativo e barra de escala. </li><li> Para ver as células em 3-D, mudar para o &quot;3-D opacidade&quot; configuração. Isto permite a rotação das células em 3-D fundidas no espaço, proporcionando assim várias perspectivas de estruturas de interesse no interior das células Nota:. É útil para visualizar as células em diferentes planos para determinar onde as estruturas de interesse de viagem. Por exemplo, no &quot;Extended Focus&quot; configuração, é difícil de discernir que o 53BP1 se, de facto, a partir de DNA dissociar durante a mitose. No entanto, este é prontamente aparente em 3-D. </li><li> Filmes e imagens estáticas podem ser exportados para uma variedade de tipos de arquivo com base na preferência do usuário. </l<html> i&gt; </ol> D. Representante Resultados Um exemplo de formação de focos 53BP1 em resposta a CPT é mostrado na Figura 1. As células expostas a forma CPT focos dentro de 5-10 min e manter estes focos em toda a duração de gravação. Como mostrado na Figura 2, 53BP1 dissocia a cromatina no início da mitose, a formação de uma névoa fina em torno dos cromossomas de condensação. Como telófase ocorre a mitose e chega ao fim, 53BP1 mais uma vez agregados em focos distintos. Enquanto as células HEK293 não foram expostas a CPT, que, no entanto, formada abundante, focos de reparação espontânea 53BP1 gerada por danos no ADN endógeno. Esta observação permitiu concluir que 53BP1 não formar focos durante a mitose no início, de acordo com um relatório anterior que mostra um efeito semelhante após a exposição das células à radiação ionizante e as drogas radiomimético 5. A Figura 1 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg / &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 | iM) provoca DSBs e formação de focos em 53BP1 ciclismo fibroblastos dentro de 30 minutos da adição do fármaco ao meio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 não formar focos durante a mitose até telophase/G1 em células HEK293.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Manutenção da integridade do genoma é essencial para a sobrevivência da célula. A falta de preservar os resultados do genoma em envelhecimento prematuro, carcinogênese, a morte ou 8. Há um grande interesse em discernir como as funções de DDR, decorrentes da sua importância para a pesquisa básica e clínica. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para ajudar no estudo de como as células detectar e reparar danos no DNA. Métodos tradicionais, como imunocitoquímica e western blotting foram pilare...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Cultura pratos CellStar </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> Pratos de vidro de fundo FluroDish </td><td> Precision mundo Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM mídia </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 19836 plasmídeo </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 plasmídeo </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Celular Zeiss Observer SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versão 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W óleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versão 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

duas e três dimensões imagens de células vivas de proteínas de dna resposta a danos

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Duplo-strand breaks (LAP) são o DNA mais deletéria lesões uma célula pode encontrar. Se deixado sem reparos, DSBs potencial grande porto para gerar mutações e aberrações cromossômicas 1. Para evitar este trauma de catalisar a instabilidade genômica, é crucial para que as células detectam DSBs, ativar a resposta de danos no DNA (DDR), e reparar o DNA. Quando estimulado, o DDR trabalha para preservar a integridade genómica, desencadeando paragem do ciclo celular para permitir a reparação para ter lugar ou forçar a célula a apoptose. Os mecanismos predominantes de reparação de DSB de ocorrer através da extremidade não homóloga-joining (NHEJ) e homóloga recombinação reparação (HRR) (revista em 2). Há muitas proteínas cujas atividades devem ser precisamente orquestrada para a DDR para funcionar corretamente. Relata-se um método para a 2 - e 3-dimensional de visualização (D) de uma destas proteínas, 53BP1. A proteína p53 de ligação 1 (53BP1) localiza a áreas deDSBs ligando-se a histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. As modificações de histonas e recrutamento de proteínas e de outros 53BP1 DDR para locais DSB são acreditados para facilitar o rearranjo estrutural da cromatina em torno das áreas de danos e de contribuir para a reparação do ADN 6. Além da participação direta na reparação, funções adicionais têm sido descritos para 53BP1 no DDR, como regular um posto de controle intra-S, um checkpoint G2 / M, e ativar proteínas jusante DDR 7-9. Recentemente, descobriu-se que não se forma 53BP1 focos em resposta ao dano do DNA induzido durante a mitose, em vez de espera para as células antes de introduzir a localização de G1 para a vizinhança de DSBs 6. Proteínas, tais como DDR 53BP1 foram encontrados para associar com estruturas de mitose (por exemplo, cinetocoros), durante a progressão através da mitose 10. Neste protocolo, descrevemos o uso de 2 - e 3-D imagens de células vivas para visualizara formação de focos 53BP1, em resposta ao agente danificador de ADN camptotecina (CPT), bem como o comportamento 53BP1 durante a mitose. A camptotecina é um inibidor da topoisomerase I, que provoca principalmente DSBs durante a replicação do ADN. Para conseguir isto, foi utilizado um anteriormente descrito 53BP1-mCherry proteína de fusão que consiste em fluorescente construir um domínio de proteína capaz de se ligar 53BP1 DSBs 11. Além disso, utilizou-se uma histona H2B-GFP fluorescente construir a proteína de fusão capaz de controlar a dinâmica da cromatina ao longo do ciclo celular, mas em particular durante a mitose 12. Imagens de células vivas em múltiplas dimensões é uma excelente ferramenta para aprofundar nossa compreensão da função de proteínas DDR em células eucarióticas.

Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

As quebras de fita dupla (DSBs) são as lesões de DNA mais deletérias que uma célula pode enfrentar. Se não forem reparadas, as DSBs possuem um grande potencial para gerar...

Esta demonstração utiliza imagens de células vivas em 2D e 3D para compreender as relações espaciais e temporais das proteínas envolvidas na resposta ao dano no DNA. Primeiro, transfete ou transduza sua linhagem celular de escolha com construtos de expressão contendo marcadores fluorescentes apropriados. Aqui, M Cherry e GFP, em seguida, adquira uma série de vídeos controle mostrando as células marcadas fluorescentemente em condições normais.Em seguida, aplique um tratamento apropriado e capture dados dos efeitos do tratamento no processo das células fluorescentes e analise os dados de vídeo para identificar as relações espaciais e temporais das proteínas. Em última instância, a microscopia de fluorescência em tempo real pode detalhar dinâmicas celulares, como a formação de focos de 53 BP1 em resposta a agentes danificadores do DNA ou o comportamento do 53 BP1 durante a mitose. Começamos a nos interessar por imagens em 2D e 3D quando desejamos estudar como diferentes tratamentos afetavam a mitose em determinadas linhagens celulares.Essa abordagem experimental permite estudar a resposta ao dano no DNA e a manutenção da estabilidade genômica mais facilmente do que os métodos tradicionais. Além disso, é possível utilizar este método para estudar como certas proteínas interagem em diversas vias de sinalização e em diferentes linhagens celulares. A principal vantagem da imagem em tempo real em relação a técnicas tradicionais como a citocitoquímica é que ela permite o estudo das proteínas da resposta ao dano no DNA em tempo real.Otimizar as condições corretas de gravação pode ser desafiador. Esta demonstração pode ser utilizada para observar os diversos pequenos passos necessários para garantir o sucesso. Lembre-se de que a persistência compensa quando se trata de minimizar o desbotamento fotográfico, encontrar os intervalos adequados de gravação e a duração ideal da gravação, entre outros.Transfecte ou transduza as linhagens celulares apropriadas com os plasmídeos para expressão das proteínas de fusão mCherry e GFP. Mantenha as culturas sob seleção com droga e verifique periodicamente a expressão das proteínas fluorescentes no dia anterior à aquisição de imagens. Recolha as células utilizando tripsina.Em seguida, semeie culturas de baixa densidade em placas de fundo de vidro com diâmetro de 3,5 centímetros. Este protocolo foi desenvolvido utilizando o microscópio confocal de disco giratório Zeiss Cell Observer SD, equipado com um suporte Axio Observer Z1. Primeiro, verifique se o gás CO₂ está sendo fornecido ao módulo de CO₂ do sistema de incubação. Se o microscópio estiver apoiado em uma mesa antivibratória Airtable, ligue então a fonte de ar para a Airtable.Agora ligue a alimentação para a unidade de disco giratório do microscópio, câmeras, módulos de incubação, iluminador HXP, estágio motorizado, laser argônio e computador. Ligue as chaves para as linhas do laser que serão utilizadas. Inicie o software Axio Vision.O software Avision pode ser personalizado com janelas e menus suspensos específicos para o microscópio e os componentes que ele controla. Assim, cada interface de usuário pode ter uma aparência única. Aproximadamente uma hora antes da aquisição de imagens, localize os controles do incubador e ligue o aquecimento para a câmara superior e para a placa da platina.Defina a temperatura em 37 graus Celsius. Ligue o controle de CO2 e ajuste o nível em 5%. Selecione a lente objetiva para a aquisição de imagens neste estudo. A lente objetiva exige o uso de um meio de imersão com índice de refração semelhante ao da água.Se for necessário imaginar múltiplas posições durante longos períodos de tempo, certifique-se de aplicar meio de imersão suficiente para que o microscópio não seque. Coloque a placa de cultura na platina e eleve a lente objetiva até o contato com a parte inferior, utilizando os controles do microscópio ou o software. Direcione a luz emitida para as oculares e selecione o conjunto de filtros de campo amplo apropriado para o sinal fluorescente de interesse.Agora, observe através das lentes oculares. Foque a imagem e localize um campo adequado de células utilizando o software ou os controles do microscópio. Direcione a luz emitida para longe das oculares, direcionando-a para a porta com a unidade de disco giratório confocal no software.Ligue o laser apropriado para este estudo. Para cada canal, ajuste a intensidade do laser regulando o controle do filtro óptico sintonizável kuo a um nível apropriado. Em seguida, selecione o espelho dicróico e os filtros de emissão adequados.Abra o obturador da unidade de disco giratório. Agora, selecione a janela ao vivo para exibir o campo de visão atual. Em seguida, abra a janela de controle da câmera.Selecione a câmera a ser utilizada e defina o tempo de exposição em aproximadamente 100 milissegundos. Ajuste a porcentagem e o ganho EM conforme necessário. Além disso, abra o controle da unidade de disco giratório confocal e ajuste a velocidade do disco giratório inserindo o tempo de exposição da câmera que foi definido para capturar uma imagem adequada.Clique em definir para confirmar a alteração. Agora, abra a janela de aquisição multidimensional. Selecione a guia de canal e carregue ou selecione os canais apropriados definidos para o Flora Fours.Para garantir o registro de imagens, utilize um espelho dicróico comum para ambos os canais. Configure o software para foco automático. Prossiga para a janela MDA e clique na guia ZS stack.Selecione a pilha ZS na posição de foco atual. Defina o intervalo para uma pilha Z de 10 mícrons e escolha o número ideal de etapas para garantir a amostragem de Nyquist ao longo do eixo Z. Agora, clique em iniciar e analise a imagem da pilha Z resultante. Selecione a aba de tempo.Defina o intervalo entre os pontos de tempo de aquisição de imagens e a duração total da sessão. Para a aquisição de imagens em múltiplos pontos de várias células na placa, abra a janela MDA. Selecione a guia de posição e verifique se a opção aplicar configuração antes ou após o ponto de tempo por posição está marcada.Agora selecione marca. Localize utilizando a visualização ao vivo, mova o prato e selecione os campos de visão apropriados. Clique em iniciar no menu de aquisição multidimensional para começar o experimento e gravar um vídeo de controle.Prossiga adicionando o tratamento apropriado e registre o vídeo experimental em intervalos de tempo determinados por um período definido. Para esta linhagem celular e para monitorar todo o processo de mitose, utilizamos um intervalo de sete minutos e meio durante quatro a cinco horas. Você precisará determinar as configurações específicas para sua linhagem celular e para o que deseja estudar.Abra o software Velocity, crie e nomeie uma nova biblioteca e importe os arquivos de vídeo experimentais para visualizar os arquivos. Tente usar a configuração de foco estendido, ajustando os vídeos conforme necessário. O Velocity possui uma variedade de ferramentas para ajudar a melhorar a qualidade das imagens adquiridas.Se as configurações do microscópio forem apropriadas, isso economizará muito tempo posteriormente na edição. Muitas vezes, é útil equalizar suas imagens e ajustar o brilho e o contraste, pois suas necessidades específicas variarão conforme seu experimento. Para visualizar as células em 3D, alterne para a configuração de opacidade 3D.Isso permite a rotação das células renderizadas em 3D no espaço, proporcionando assim múltiplas perspectivas das estruturas de interesse dentro das células. Filmes. Imagens fixas podem ser exportadas para diversos tipos de arquivos conforme preferência do usuário. Em comparação com os controles, células de fibroblastos expostas à CPT formaram focos entre cinco e dez minutos e mantiveram esses focos durante todo o período de gravação.Curiosamente, em células renais embrionárias humanas, a 53BP1 se dissocia da cromatina no início da mitose, formando uma leve névoa ao redor dos cromossomos em condensação. À medida que a telófase ocorre e a mitose chega ao fim, a 53BP1 novamente se agrega em focos distintos. Esperamos que este vídeo permita que você estude as relações espaço-temporais de proteínas envolvidas na resposta ao dano do DNA, bem como em outras vias.Por exemplo, no campo da dinâmica da cromatina, esta técnica foi utilizada para estudar como a ligação da 53 BP1 afeta o movimento das extremidades teloméricas do DNA. Após a criação de células geneticamente modificadas, a microscopia de células vivas em duas e três dimensões pode ser realizada em aproximadamente quatro a oito horas. Certifique-se de que as configurações do microscópio sejam ajustadas adequadamente para obter uma imagem ideal.

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

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Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

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Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

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