Geração e Análise Transcriptômica de Célula Única de Organoides de Carcinoma Hepatocelular após Tratamento Medicamentoso

Focamos em como os organoides do HCC respondem ao tratamento medicamentoso e como seus estudos translacionais mudam no trabalho. Esse protocolo é útil para organoides de HCC e também pode ser adaptado a outros sistemas organoides tumorais. Para começar, estabeleça carcinomas hepatocelulares ou organoides derivados do paciente com HCC e prepare-os para perturbação terapêutica.

Prepare a solução de estoque de lenvatibe em dimetilsulfóxido, ou DMSO, conforme as instruções do fabricante. Dilua a solução de estoque em meio de cultura pré-aquecida imediatamente antes do uso, até a concentração de trabalho pré-definida. Prepare solução suficiente para alcançar volumes finais iguais em todos os poços, garantindo a mesma concentração de DMSO em cada poço.

Em seguida, adicione um contendo lenvatinibe a 20 micromolares ao longo da parede de cada poço para evitar perturbar as cúpulas da matriz. Inclua um controle de veículo com a mesma concentração final de DMSO. Incubar os organoides sob condições padrão de cultura durante o período de tratamento pré-definido.

Para tratamentos com mais de 72 horas, substitua o meio contendo medicamento a cada 48 a 72 horas, garantindo um cronograma consistente de substituição em todos os poços. Registre imagens de campo claro de base antes do tratamento. Adquira imagens em intervalos fixos durante o tratamento usando configurações idênticas do microscópio, ampliação e posições de campo.

Para avaliação baseada em morfologia da resposta ao tratamento, utilize configurações de exposição, ampliação e limiares de análise idênticos para todas as imagens. Meça a curva de crescimento da área organoide calculando a área total do organoide, por poço ou campo, em cada ponto de tempo, e normalizando os valores para a linha de base. Para medir o diâmetro médio dos organoides, determine o diâmetro de organoides individuais intactos e calcule o valor médio por poço.

Em seguida, determine a contagem de organoides sobreviventes contando organoides intactos morfologicamente identificáveis, excluindo quaisquer detritos ou fragmentos colapsados. Realize um ensaio tridimensional de viabilidade por luminescência no ponto final do tratamento se for necessária uma avaliação adicional de viabilidade em massa seguindo as instruções do fabricante. Depois, plote as curvas de crescimento da área organoide ao longo do tempo.

Compare o diâmetro médio dos organoides entre os grupos tratados com veículo e os tratados com lenvatinibe. Além disso, compare as contagens de organoides sobreviventes entre os grupos de tratamento. Garantir o uso de cronogramas de imagem, critérios de inclusão e parâmetros de análise consistentes para garantir a reprodutibilidade.

Selecione poços organoides com morfologia 3D intacta, material suficiente para captura de célula única e sem contaminação visível. Registre imagens em campo claro de cada uma selecionada muito antes da dissociação, usando configurações idênticas de microscópio, ampliação e critérios de seleção de campo. Colete organoides em pontos de tempo correspondentes entre grupos controle e tratados, mantendo densidade de placa, cronograma de tratamento e condições de substituição de médio idênticas em todas as amostras.

Aspire completamente o meio de cultura de cada poço. Lave cada poço duas vezes com PBS gelado para remover o meio residual e os detritos. Adicione um mililitro de solução de recuperação de células geladas em cada poço e incube no gelo por 20 a 30 minutos.

Pipete suavemente a cada cinco a sete minutos durante a incubação para facilitar a dissolução da matriz. Transfira o material dissolvido para tubos pré-resfriados usando uma ponta de tubo largo ou de pipeta cortada para minimizar o estresse de cisalhamento. Prossiga para a dissociação enzimática somente depois que a matriz estiver em grande parte dissolvida e restar um mínimo de resíduos visíveis de gel.

Centrifuge a suspensão organoide recuperada a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante com cuidado, sem mexer na bola. Ressuspenda o pellet em um mililitro de enzima de dissociação celular recombinante e incube a 37 graus Celsius por cinco a dez minutos.

Pipete suavemente de oito a dez vezes a cada dois a três minutos, usando uma ponta P1000 de grande diâmetro, para promover a dissociação. Interrompa a digestão quando a maioria dos fragmentos organoides já se dispersou em células individuais, e restam apenas pequenos aglomerados residuais. Em seguida, adicione quatro mililitros de soro bovino fetal com 2% de PBS gelado para interromper a digestão.

Depois, filtre a suspensão por um filtro de célula de 40 micrômetros. Lave uma vez com PBS para remover enzimas residuais, agregados e detritos. Conte as células usando a exclusão do azul de tripano.

Após garantir a viabilidade celular de 85% ou mais, ajuste a concentração final da célula para 700 a 1.200 células por microlitro. Exclua amostras com detritos excessivos, células mortas abundantes, grandes agregados visíveis ou dissociação incompleta. Repita a filtragem antes da carga se houver agregados presentes.

Controle de processo e amostras tratadas sob condições idênticas, incluindo a enzima de dissociação, tempo de digestão, frequência de pipeteamento, método de filtragem, concentração celular e estratégia de carga. Finalmente, após a amplificação da biblioteca de célula única, realize o sequenciamento de célula única. Organoides sobreviveram e se expandiram sob condições padrão de cultura tridimensional do primeiro ao sexto dia após a recuperação.

No primeiro dia, os organoides apareciam como pequenas estruturas compactas, enquanto no sexto dia apresentavam aumento de tamanho e morfologia bem definida. Os organoides tratados com lenvatinibe eram menores e apresentavam morfologia alterada em comparação com os controles tratados com DMSO. A análise quantitativa mostrou redução no diâmetro médio do organoide, após o tratamento com lenvatinibe, em comparação com os controles DMSO.

Esse protocolo nos permite estudar mudanças no estado celular, composição celular e expressão gênica após o tratamento. O maior desafio é preservar a viabilidade celular, mantendo o processamento simples consistente em todos os grupos. A análise posterior celular pode ser realizada seguindo esse procedimento, incluindo agrupamento, análise de experimentos diferenciais de genes, análise de enriquecimento de vias e inferência de tesouraria.