Еще в начале 20-го века британский бактериолог по имени Фредерик Гриффит работал с бактерией, вызывающей пневмонию, Streptococcus pneumoniae. Он провел простой эксперимент с использованием двух разных штаммов. Один штамм известен как штамм S из-за защитной капсулы, которая делает колонии или комки, которые он образует, гладкими, а также делает его вирулентным или вредным. Вторым был штамм R, версия бактерии, лишенная защитной капсулы, придающая колониям грубый вид и делающая их невирулентными.
Во-первых, Гриффит взял несколько бактерий штамма S и нагрел их, получив убитую при нагревании версию штамма S. Затем он собрал несколько мышей и разделил их на четыре группы. В первую группу он ввел вирулентный штамм S, а во вторую — невирулентный штамм R. Он ввел в третью группу убитый теплом штамм S и, наконец, объединил убитый теплом штамм S и штамм R и ввел эту смесь в четвертую группу. Как и ожидалось, мыши из первой группы умерли, а мыши из второй и третьей группы выжили. Но, к удивлению Гриффита, мыши из последней группы также погибли.
Когда он опубликовал свое исследование в 1928 году, он назвал этот процесс трансформацией, поскольку предположил наличие лежащего в основе трансформирующего принципа, который позволил ранее невирулентному штамму стать смертельно опасным. Позже, в 1943 году, Аверт, Маклауд и Маккарти сообщили, что этим преобразующим принципом, вероятно, является дезоксирибонуклеиновая кислота, или ДНК, которая, как мы теперь знаем, является материалом наследственности. По сути, в эксперименте Гриффита произошло следующее: когда бактерии были объединены, некоторое количество ДНК просочилось из убитого теплом штамма S в клетки штамма R, трансформируя эти невирулентные бактерии и передавая информацию для создания защитной капсулы, превращая штамм R в вирулентный, теперь способный убивать животных четвертой группы.
Перенесемся в сегодняшний день, и ученые разработали гораздо более простой способ изучения бактериальной трансформации, используя бактерии E. coli и небольшие кольцевые петли ДНК, называемые плазмидами. Обычно плазмида, используемая в экспериментах по трансформации, включает в себя ген для определенной функции, такой как устойчивость к антибиотикам. Кишечная палочка является отличным объектом для трансформации, потому что она может проявлять свойство, называемое компетенцией, способность впитывать ДНК из окружающей среды. По сути, это означает, что при определенных условиях окружающей среды, таких как химический, электрический или тепловой удар, клеточная стенка кишечной палочки может стать временно проницаемой и позволить поглощению ДНК из окружающей среды. Как только плазмида оказывается внутри кишечной палочки, она может либо находиться в цитоплазме своей новой клетки-хозяина и реплицироваться и экспрессироваться на протяжении поколений вместе с геномом, либо она может полностью инкорпорироваться в геном хозяина. Если бактерии потеряют плазмиду в какой-либо момент, клетка также потеряет свою устойчивость к антибиотикам, поэтому ученые выращивают бактерии в среде, содержащей антибиотик, чтобы гарантировать, что единственными выжившими будут те, кто содержит интересующую плазмиду.
В этой лаборатории вы узнаете, как трансформировать клетки кишечной палочки с помощью плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, практикуя при этом стерильные микробиологические методы.
Фон
В начале20-го века пневмония была причиной значительной части смертей от инфекционных заболеваний. Чтобы разработать эффективную вакцину против пневмонии, Фредерик Гриффит решил изучить два различных штамма Streptococcus pneumoniae: невирулентный штамм с грубым внешним видом (R-штамм) и вирулентный штамм с гладким внешним видом (S-штамм) благодаря внешней полисахаридной капсуле2. Этот внешний слой бактерий S-штамма позволил им противостоять иммунной системе хозяина, что в конечном итоге привело к опасному для жизни заболеванию. Когда Гриффит отдельно вводил мышам убитые теплом бактерии любого штамма, мыши выжили. Однако, когда он вводил мышам комбинацию убитого теплом штамма S-штамма с живым R-штаммом, мыши умерли2. Когда он проанализировал образцы, полученные от мертвых мышей, которым вводили эту комбинацию, он заметил присутствие живых бактерий S-штамма. В 1928 году Гриффит отметил, что должен был произойти процесс «трансформации», чтобы превратить невирулентные бактерии в вирулентный штамм. Будучи первым известным открытием бактериальной трансформации, его открытие проложило путь к развитию важнейшего инструмента в генной инженерии - трансформации3.
Трансформация – это генетическое изменение в клетке в результате поступления ДНК из окружающей среды. В эксперименте Гриффита ДНК, кодирующая защитное полисахаридное покрытие бактерий S-штамма, не разрушилась от теплового шока и была введена в R-штамм, позволив последнему обойти иммунную систему мыши. В то время как этот процесс постоянно происходит в дикой природе между организмами и даже различными видами, ученые преобразуют бактерии в лабораторных условиях для исследовательских целей.
Бактериальная трансформация с помощью плазмид
Бактерии являются идеальными организмами для трансформации, так как они могут легко поглощать экзогенный генетический материал в свой геном и быстро амплифицировать его3,5. Они имеют одну кольцевую хромосому и несколько небольших кольцевых фрагментов двухцепочечной ДНК, называемых плазмидами внутри цитоплазмы. Эти плазмиды могут реплицироваться независимо от хромосомной ДНК и в целом обеспечивают определенные функциональные преимущества, такие как устойчивость к антибиотикам6,7. В своей естественной среде бактерии претерпевают «бактериальную трансформацию», поглощая плазмиды других бактерий в процессе, называемом конъюгацией8. Более того, когда они размножаются, каждый из их потомков получает копию новой плазмиды.
Плазмиды, которые используются в экспериментальных целях, называются плазмидными векторами. В лабораторных условиях ученые могут искусственно создать «рекомбинантные плазмиды», которые имеют длину примерно 5000-10000 пар оснований, вставив фрагменты ДНК в плазмидный вектор. Эти рекомбинантные плазмиды обычно имеют определенные компоненты: начало репликации (ОРИ), ген устойчивости к антибиотикам, сайт множественного клонирования, промотор, маркер отбора и ген, представляющий интерес. Истоки репликации — это то, с чего начинается репликация. Ген устойчивости к антибиотикам позволяет бактериям, которые поглощают плазмиду, выживать на пластинах в присутствии определенного антибиотического препарата. Несмотря на то, что плазмиды представляют собой относительно небольшие участки ДНК, ученым необходимо обрабатывать клетки-хозяева, чтобы плазмида могла проникнуть через клеточную мембрану. Следовательно, эффективность трансформации напрямую связана с пористостью мембраны хозяина. Одним из распространенных подходов является тепловой шок бактерий, которые были обработаны раствором хлорида кальция9. Бактерии, которые не включают в себя плазмиду, не трансформируются и, следовательно, не имеют сопротивления выживанию на пластине и быть видимыми. Множественные сайты клонирования способствуют встраиванию ДНК, содержа сайты для ферментов рестрикции, чтобы разрезать плазмиду, где может быть вставлен и лигирован интересующий ген. Промотор управляет транскрипцией интересующего гена. Он помечается маркером, обычно флуоресцентным белком, таким как зеленый флуоресцентный белок (GFP), или может быть дополнительным геном устойчивости к антибиотикам. Ген устойчивости к антибиотикам и другие маркеры отбора помогают нам определить, содержат ли собранные бактерии интересующую нас плазмиду.
Приложений
Эффективные методы трансформации позволили ученым изолировать и профилировать гены и генные продукты и привели к многочисленным достижениям в науках о жизни и медицине, таким как разработка эффективных лекарств, создание генетически модифицированных культур и передовые диагностические инструменты. Кроме того, с развитием технологий появились новые методы трансформации. Например, Gateway Cloning позволяет вставлять множественные фрагменты ДНК в разные векторы, а также переносить последовательности ДНК между плазмидами11. Кроме того, сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR)-Cas9 представляют собой метод редактирования генов, который непосредственно модифицирует нуклеотиды в геноме и не требует использования плазмид12. После трансформации исследователи часто выделяют и профилируют интересующий ген и его продукты. Впоследствии весь процесс генетического клонирования открыл новую область генетических манипуляций. Благодаря генетическому клонированию исследователи могут манипулировать бактериями для производства большого количества специфических человеческих белков, таких как инсулин, длялечения пациентов с диабетом. Клонирование также играет важную роль в современном сельском хозяйстве. Генетически модифицированные организмы (ГМО) являются прямым результатом генетического клонирования и бактериальной трансформации10. Например, ученые работают над созданием генетически модифицированных культур с азотфиксирующими генами, встроенными в их геном, чтобы увеличить производство продуктов питания и сократить использование удобрений, тем самым уменьшая экономическое и экологическое воздействиеудобрений. Подводя итог, можно сказать, что бактериальная трансформация является первым шагом современной биотехнологии и фундаментом для будущих научных открытий.
Ссылки
- Г.Л., Армстронг, Л.А., Конн и Р.В., Пиннер. Тенденции смертности от инфекционных заболеваний в Соединенных Штатах в течение 20-го века. ДЖАМА. 1999, Vol. 281, 1 (61-66).
- Ф., Гриффит. Значение пневмококковых типов. J Hyg (Lond). . .1928 , 2 (113-59).
- Лоренц, М.Г. и Вакернагель, Ф. Перенос бактериальных генов путем естественной генетической трансформации в окружающей среде. Микробиол Rev. . 1994 сентябрь, том 58, 3: (563-602).
- S, Domingues, et al. Естественная трансформация облегчает перенос транспозонов, интегронов и генных кассет между видами бактерий. Патогены PLOS. 2012, 8(8): e1002837.
- Dubnau, D. Поглощение ДНК бактериями. Annu Rev Microbiol. . . 1999, 53: (217-44).
- Solar, G del, et al. Репликация и контроль кольцевых бактериальных плазмид. Микробиол Мол Биол Rev. . 1998 , Том 62, 2: (434-64).
- Беннетт,.М. Плазмида кодирует устойчивость к антибиотикам: приобретение и перенос генов устойчивости к антибиотикам у бактерий. Br J Pharmacol. . . 2008 , том 153, S1: (S347-S357).
- MLlosa, et al. Бактериальная конъюгация: двухступенчатый механизм транспортировки ДНК. Мол Микробиол. 2002 июль;, том 45, 1: (1-8).
- Ройчоудхури, А., Басу, С. и Сенгупта, Д.Н. Анализ сравнительной эффективности различных методов трансформации E. coli с использованием двух распространенных плазмидных векторов. Indian J Biochem Biophys. . . 2009 , Том 46, 5: (395-400).
- Khan, S, et al. Роль технологии рекомбинантной ДНК в улучшении жизни. I. nt J Genomics. . . 2016, 2016:2405954.
- Марсишки, Г. и ЛаБаер, Дж. Множество путей к множеству клонов: сравнительный взгляд на методы клонирования с высокой пропускной способностью. Genome Res. 2004, Том 14, 2020-28.
- Дудна, Дж.А. и Шарпенти, Э. Новый рубеж геномной инженерии с CRISPR-Cas9. наука. 2014, Том 346, 6213-1258096.
- Гуд, А. В сторону азотфиксирующих растений. наука. 2018, Том 359, 6378: 869-70.
Еще в начале 20-го века британский бактериолог по имени Фредерик Гриффит работал с бактерией, вызывающей пневмонию, Streptococcus pneumoniae. Он провел простой эксперимент с использованием двух разных штаммов. Один штамм известен как штамм S из-за защитной капсулы, которая делает колонии или комки, которые он образует, гладкими, а также делает его вирулентным или вредным. Вторым был штамм R, версия бактерии, лишенная защитной капсулы, придающая колониям грубый вид и делающая их невирулентными.
Во-первых, Гриффит взял несколько бактерий штамма S и нагрел их, получив убитую при нагревании версию штамма S. Затем он собрал несколько мышей и разделил их на четыре группы. В первую группу он ввел вирулентный штамм S, а во вторую — невирулентный штамм R. Он ввел в третью группу убитый теплом штамм S и, наконец, объединил убитый теплом штамм S и штамм R и ввел эту смесь в четвертую группу. Как и ожидалось, мыши из первой группы умерли, а мыши из второй и третьей группы выжили. Но, к удивлению Гриффита, мыши из последней группы также погибли.
Когда он опубликовал свое исследование в 1928 году, он назвал этот процесс трансформацией, поскольку предположил наличие лежащего в основе трансформирующего принципа, который позволил ранее невирулентному штамму стать смертельно опасным. Позже, в 1943 году, Аверт, Маклауд и Маккарти сообщили, что этим преобразующим принципом, вероятно, является дезоксирибонуклеиновая кислота, или ДНК, которая, как мы теперь знаем, является материалом наследственности. По сути, в эксперименте Гриффита произошло следующее: когда бактерии были объединены, некоторое количество ДНК просочилось из убитого теплом штамма S в клетки штамма R, трансформируя эти невирулентные бактерии и передавая информацию для создания защитной капсулы, превращая штамм R в вирулентный, теперь способный убивать животных четвертой группы.
Перенесемся в сегодняшний день, и ученые разработали гораздо более простой способ изучения бактериальной трансформации, используя бактерии E. coli и небольшие кольцевые петли ДНК, называемые плазмидами. Обычно плазмида, используемая в экспериментах по трансформации, включает в себя ген для определенной функции, такой как устойчивость к антибиотикам. Кишечная палочка является отличным объектом для трансформации, потому что она может проявлять свойство, называемое компетенцией, способность впитывать ДНК из окружающей среды. По сути, это означает, что при определенных условиях окружающей среды, таких как химический, электрический или тепловой удар, клеточная стенка кишечной палочки может стать временно проницаемой и позволить поглощению ДНК из окружающей среды. Как только плазмида оказывается внутри кишечной палочки, она может либо находиться в цитоплазме своей новой клетки-хозяина и реплицироваться и экспрессироваться на протяжении поколений вместе с геномом, либо она может полностью инкорпорироваться в геном хозяина. Если бактерии потеряют плазмиду в какой-либо момент, клетка также потеряет свою устойчивость к антибиотикам, поэтому ученые выращивают бактерии в среде, содержащей антибиотик, чтобы гарантировать, что единственными выжившими будут те, кто содержит интересующую плазмиду.
В этой лаборатории вы узнаете, как трансформировать клетки кишечной палочки с помощью плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, практикуя при этом стерильные микробиологические методы.
Еще в начале 20-го века британский бактериолог по имени Фредерик Гриффит работал с бактерией, вызывающей пневмонию, Streptococcus pneumoniae. Он провел простой эксперимент с использованием двух разных штаммов. Один штамм известен как штамм S из-за защитной капсулы, которая делает колонии или комки, которые он образует, гладкими, а также делает его вирулентным или вредным. Вторым был штамм R, версия бактерии, лишенная защитной капсулы, придающая колониям грубый вид и делающая их невирулентными.
Во-первых, Гриффит взял несколько бактерий штамма S и нагрел их, получив убитую при нагревании версию штамма S. Затем он собрал несколько мышей и разделил их на четыре группы. В первую группу он ввел вирулентный штамм S, а во вторую — невирулентный штамм R. Он ввел в третью группу убитый теплом штамм S и, наконец, объединил убитый теплом штамм S и штамм R и ввел эту смесь в четвертую группу. Как и ожидалось, мыши из первой группы умерли, а мыши из второй и третьей группы выжили. Но, к удивлению Гриффита, мыши из последней группы также погибли.
Когда он опубликовал свое исследование в 1928 году, он назвал этот процесс трансформацией, поскольку предположил наличие лежащего в основе трансформирующего принципа, который позволил ранее невирулентному штамму стать смертельно опасным. Позже, в 1943 году, Аверт, Маклауд и Маккарти сообщили, что этим преобразующим принципом, вероятно, является дезоксирибонуклеиновая кислота, или ДНК, которая, как мы теперь знаем, является материалом наследственности. По сути, в эксперименте Гриффита произошло следующее: когда бактерии были объединены, некоторое количество ДНК просочилось из убитого теплом штамма S в клетки штамма R, трансформируя эти невирулентные бактерии и передавая информацию для создания защитной капсулы, превращая штамм R в вирулентный, теперь способный убивать животных четвертой группы.
Перенесемся в сегодняшний день, и ученые разработали гораздо более простой способ изучения бактериальной трансформации, используя бактерии E. coli и небольшие кольцевые петли ДНК, называемые плазмидами. Обычно плазмида, используемая в экспериментах по трансформации, включает в себя ген для определенной функции, такой как устойчивость к антибиотикам. Кишечная палочка является отличным объектом для трансформации, потому что она может проявлять свойство, называемое компетенцией, способность впитывать ДНК из окружающей среды. По сути, это означает, что при определенных условиях окружающей среды, таких как химический, электрический или тепловой удар, клеточная стенка кишечной палочки может стать временно проницаемой и позволить поглощению ДНК из окружающей среды. Как только плазмида оказывается внутри кишечной палочки, она может либо находиться в цитоплазме своей новой клетки-хозяина и реплицироваться и экспрессироваться на протяжении поколений вместе с геномом, либо она может полностью инкорпорироваться в геном хозяина. Если бактерии потеряют плазмиду в какой-либо момент, клетка также потеряет свою устойчивость к антибиотикам, поэтому ученые выращивают бактерии в среде, содержащей антибиотик, чтобы гарантировать, что единственными выжившими будут те, кто содержит интересующую плазмиду.
В этой лаборатории вы узнаете, как трансформировать клетки кишечной палочки с помощью плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, практикуя при этом стерильные микробиологические методы.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved