$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Флуоресценция — это явление, при котором вещество поглощает свет на определенной длине волны и излучает свет на другой длине волны. Флуоресценция происходит, когда электрон, перешедший в более высокое и менее стабильное энергетическое состояние, возвращается в основное состояние, испуская фотон света. Свет, вызывающий возбуждение, или перенос электрона в состояние с более высокой энергией, имеет более короткую длину волны и более высокую энергию, чем флуоресцентное излучение, которое характеризуется большей длиной волны, меньшей энергией и другим цветом.
Флуоресцентная микроскопия сочетает в себе увеличительные свойства светового микроскопа с технологией флуоресценции, которая позволяет возбуждать и регистрировать излучение флуорофоров — флуоресцентных химических соединений. С помощью флуоресцентной микроскопии ученые могут наблюдать локализацию специфических типов клеток в тканях или молекул внутри клеток.
Основные компоненты флуоресцентного микроскопа во многом совпадают с компонентами традиционного светового микроскопа. Однако два основных отличия заключаются в типе источника света и использовании специализированных фильтрующих элементов.
Флуоресцентная микроскопия требует очень мощного источника света, такого как ксеноновая или ртутная дуговая лампа, подобная той, что показана здесь. Свет, излучаемый ртутной дуговой лампой, в 10–100 раз ярче, чем у большинства ламп накаливания, и обеспечивает освещение в широком диапазоне длин волн — от ультрафиолетового до инфракрасного. Этот мощный источник света является самой опасной частью установки флуоресцентного микроскопа, так как взгляд непосредственно на нефильтрованный свет может серьезно повредить сетчатку глаз, а неправильное обращение с лампами может привести к их взрыву.
Принцип работы флуоресцентной микроскопии прост. Свет, выходящий из дуговой лампы, проходит через возбуждающий фильтр, который отбирает длину волны возбуждения.
Этот свет отражается в сторону образца специальным зеркалом, называемым дихроичным зеркалом, которое предназначено для отражения света только на длине волны возбуждения. Отраженный свет проходит через объектив, где он фокусируется на флуоресцентном объекте. Излучение от объекта, в свою очередь, проходит обратно через объектив, где происходит увеличение изображения, а затем через дихроичное зеркало.
Этот свет фильтруется барьерным фильтром, который отбирает длину волны эмиссии и отсекает посторонний свет от дуговой лампы или других источников, отражающийся от компонентов микроскопа. Наконец, отфильтрованное флуоресцентное излучение направляется на детектор для оцифровки изображения или передается в окуляр для визуального наблюдения.
Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и барьерный фильтр могут быть объединены в один компонент, известный как фильтр-куб. При наблюдении образца можно менять фильтр-кубы для изменения длины волны возбуждения, а серия диафрагм может быть использована для регулировки интенсивности возбуждения.
При проведении флуоресцентной микроскопии выбор флуорофора может быть столь же важен, как и сам микроскоп; тип используемого флуорофора определяет длину волны возбуждения и длину волны детектируемой эмиссии. Длины волн возбуждения охватывают узкий диапазон энергий, которые могут поглощаться флуорофором, переводя его в возбужденное состояние. После возбуждения возможен широкий спектр эмиссий, или переходов обратно в низкоэнергетическое состояние, что приводит к формированию спектра эмиссии.
Разница между пиком кривой поглощения (возбуждения) и пиком кривой эмиссии известна как стоксов сдвиг. Чем больше величина этого сдвига, тем легче разделить две различные длины волн. Кроме того, любые перекрывающиеся спектры должны быть удалены компонентами фильтр-куба для снижения фона и улучшения качества изображения.
Длительное воздействие возбуждающего света на флуорофор вызывает его фотовыцветание, что проявляется в ослаблении или полной потере флуоресценции. Чтобы уменьшить фотовыцветание, можно добавить на предметное стекло антифейдинговую среду для заключения препарата и запечатать края лаком для ногтей. Кроме того, предметное стекло следует хранить в темноте, когда оно не используется для съемки.
Для начала флуоресцентной визуализации включите ксеноновый или ртутный источник света и дайте ему прогреться в течение 15 минут для достижения стабильной интенсивности освещения.
Затем поместите образец на предметный столик и зафиксируйте его. После этого включите источник белого света микроскопа. Сфокусируйтесь на образце, используя объектив с наименьшим увеличением, регулируя ручки грубой и точной фокусировки. Затем с помощью винтов перемещения столика найдите интересующую вас область.
Далее выключите источник белого света, а также любой ненужный комнатный свет для уменьшения фона.
Выберите соответствующий фильтр-куб для красителя, который вы визуализируете, и откройте затвор, чтобы осветить образец.
Наконец, выполните точную фокусировку и направьте световой поток на камеру. Вероятно, вам потребуется отрегулировать время экспозиции для каждого используемого флуорофора или флуоресцентного красителя. Однако важно сохранять время экспозиции постоянным при сравнении характеристик одного и того же красителя на разных образцах.
Для визуализации нескольких красителей в одном образце меняйте фильтр-куб в соответствии с каждым флуорофором и записывайте каждое новое изображение.
После визуализации всех красителей в образце отдельные изображения можно наложить друг на друга и объединить.
Множество различных типов экспериментов могут использовать флуоресцентную микроскопию и задействовать разные виды флуорофоров. Одно из наиболее распространенных применений флуоресцентной микроскопии — визуализация белков, меченных антителами, которые присоединены или «конъюгированы» с флуоресцентными соединениями. В данном случае антитело к поверхностным белкам лептоспир была обнаружена с помощью вторичного антитела, конъюгированного с alexafluor-488, которое при возбуждении флуоресцирует зеленым цветом.
Другим способом выделить определенную структуру с помощью флуоресценции является интеграция кода флуоресцентного белка, такого как зеленый флуоресцентный белок, или GFP, в ДНК организма. Ген GFP был изначально выделен из медузы и может экспрессироваться, то есть вырабатываться, культивируемыми клетками в ответ на специфические триггеры или как часть определенного типа клеток, например, опухолевых клеток, которые светятся на этом изображении.
Еще одним применением флуоресцентной визуализации является флуоресцентная спекл-микроскопия — технология, в которой используются флуоресцентно меченные макромолекулярные ансамбли, такие как сеть F-актина, представленная здесь, для изучения движения и кинетики обновления этого важного белка цитоскелета.
Сложный метод, известный как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, или FRAP, заключается в преднамеренном фотообесцвечивании небольшого участка образца для мониторинга скорости диффузии флуоресцентно меченных молекул обратно в область фотообесцвечивания.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по флуоресцентной микроскопии.
В этом видео мы изучили концепцию флуоресценции, определили отличия флуоресцентной микроскопии от световой микроскопии и узнали, как получать флуоресцентные изображения с помощью микроскопа. Мы также ознакомились с некоторыми базовыми и продвинутыми методами применения флуоресценции. Спасибо за просмотр и помните: хотя фотоотбеливание выглядит отлично для ваших зубов, оно крайне вредно для ваших образцов.
