$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Флуоресценция — это явление, которое происходит, когда вещество поглощает свет на заданной длине волны и излучает свет на другой длине волны. Флуоресценция проявляется в том, что электрон, который был возбужден до более высокого и более нестабильного энергетического состояния, расслабляется до своего основного состояния и испускает фотон света. Свет, который отвечает за возбуждение или перемещение электрона в более высокое энергетическое состояние, имеет более короткую длину волны и более высокую энергию, чем флуоресцентное излучение, которое имеет большую длину волны, меньшую энергию и другой цвет.
Флуоресцентная микроскопия сочетает в себе увеличительные свойства светового микроскопа с флуоресцентной технологией, которая позволяет возбуждать и обнаруживать излучение флуорофоров - флуоресцентных химических соединений. С помощью флуоресцентной микроскопии ученые могут наблюдать за расположением определенных типов клеток в тканях или молекул внутри клеток.
Основные компоненты флуоресцентного микроскопа сильно перекрываются с традиционным световым микроскопом. Тем не менее, 2 основных отличия заключаются в типе источника света и использовании специализированных фильтрующих элементов.
Для флуоресцентной микроскопии требуется очень мощный источник света, такой как ксеноновая или ртутная арочная лампа, подобная показанной здесь. Свет, излучаемый ртутной дуговой лампой, в 10-100 раз ярче, чем у большинства ламп накаливания, и обеспечивает свет в широком диапазоне длин волн, от ультрафиолетового до инфракрасного. Этот мощный источник света является самой опасной частью флуоресцентного микроскопа, так как прямой взгляд на нефильтрованный свет может серьезно повредить сетчатку, а неправильное обращение с лампочками может привести к их взрыву.
Принцип флуоресцентной микроскопии прост. Когда свет покидает дуговую лампу, он направляется через возбудительный фильтр, который выбирает длину волны возбуждения.
Этот свет отражается в сторону образца специальным зеркалом, называемым дихроичным зеркалом, которое предназначено для отражения света только на длине волны возбуждения. Отраженный свет проходит через объектив, где он фокусируется на флуоресцентном образце. Излучение образца, в свою очередь, проходит обратно через объектив, где происходит увеличение изображения, а теперь через дихроичное зеркало.
Этот свет фильтруется барьерным фильтром, который отбирает длину волны излучения и отфильтровывает загрязняющий свет от дуговой лампы или других источников, которые отражаются от компонентов микроскопа. Наконец, отфильтрованное флуоресцентное излучение направляется на детектор, где изображение может быть оцифровано, или передается на окуляр для оптического просмотра.
Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и барьерный фильтр могут быть собраны вместе в компонент, известный как фильтрующий куб. Различные кубы фильтра могут быть изменены во время просмотра образца для изменения длины волны возбуждения, а ряд диафрагм может быть использован для изменения интенсивности возбуждения.
Когда дело доходит до выполнения флуоресцентной микроскопии, флуорофор может быть так же важен, как и сам микроскоп, а тип визуализируемого флуорофора определяет используемую длину волны возбуждения и длину волны излучения, которая обнаруживается. Длины волн возбуждения содержат небольшой диапазон энергий, которые могут быть поглощены флуорофором и вызвать его переход в возбужденное состояние. После возбуждения возможен широкий диапазон излучений или переход обратно в более низкое энергетическое состояние, что приводит к спектру излучения.
Разница между пиком поглощения, или кривой возбуждения, и пиком кривой излучения известна как сдвиг Стока. Чем больше расстояние в этом сдвиге, тем легче разделить две разные длины волн. Кроме того, любой перекрывающийся спектр должен быть удален компонентами куба фильтра для уменьшения фона и улучшения качества изображения.
Воздействие на флуорофор длительного возбуждения приведет к его фотообесцвечиванию, что приведет к ослаблению или потере флуоресценции. Чтобы уменьшить фотообесцвечивание, вы можете добавить на слайд монтажную среду, предотвращающую выцветание, и заклеить края лаком для ногтей. Предметное стекло также следует хранить в темноте, когда оно не является изображением.
Чтобы начать флуоресцентную визуализацию, включите ксеноновый или ртутный источник света и дайте ему прогреться в течение 15 минут, чтобы он достиг постоянной освещенности.
Затем поместите образец на столик и закрепите его на месте. Затем включите источник белого света микроскопа. Сфокусируйтесь на образце с помощью объектива с наименьшей мощностью, регулируя ручки грубой и тонкой фокусировки. Затем с помощью ручек регулировки сцены найдите интересующую вас область.
Далее выключите белый источник света, а также все ненужные лампы в комнате, чтобы уменьшить фон.
Выберите правильный куб фильтра для красителя, который вы фотографируете, и откройте затвор, чтобы осветить образец.
Наконец, выполните точную настройку фокусировки и направьте выходной свет на камеру изображения. Скорее всего, вам придется внести коррективы во время воздействия для каждого используемого флуорофора или флуоресцентного красителя. Тем не менее, важно сохранять постоянное время экспозиции при сравнении характеристик с одним и тем же красителем на разных образцах.
Чтобы получить изображение нескольких красителей на одном образце, измените куб фильтра в соответствии с каждым флуорофором и запишите новое изображение.
После того, как изображение каждого красителя в образце было получено, отдельные изображения могут быть наложены друг на друга и объединены.
Флуоресцентная микроскопия может проводиться во многих различных типах экспериментов с использованием различных типов флуорофоров. Здесь антитело к лептоспиральным поверхностным белкам было обнаружено с использованием вторичного антитела, конъюгированного с alexafluor-488, которое флуоресцирует зеленым цветом при возбуждении.
Еще один способ выделить специфическую особенность флуоресценции — интегрировать код флуоресцентного белка, такого как зеленый флуоресцентный белок, или GFP, в ДНК организма. Ген GFP был первоначально выделен из медуз и может экспрессироваться или продуцироваться культивируемыми клетками в ответ на определенные триггеры или как часть определенного типа клеток, таких как опухолевые клетки, показанные светящимися на этом изображении
Еще одним применением флуоресцентной визуализации является флуоресцентная спекл-микроскопия, которая представляет собой технологию, использующую флуоресцентно меченные макромолекулярные сборки, такие как F-актиновая сеть, представленную здесь, для изучения движения и кинетики оборота этого важного белка цитоскелета.
Усовершенствованный метод, известный как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, или FRAP, выполняется путем преднамеренного фотообесцвечивания небольшой области образца с целью мониторинга скорости диффузии флуоресцентно меченых молекул обратно в фотообесцвеченную область.
Вы только что посмотрели введение JoVE в флуоресцентную микроскопию.
В этом видео мы узнали о понятии флуоресценции, чем флуоресцентная микроскопия отличается от световой и как получить флуоресцентное изображение через эндоскоп. Мы также узнали о некоторых базовых и продвинутых приложениях, использующих флуоресценцию. Спасибо, что смотрите, и не забывайте, что хотя фотообесцвечивание отлично смотрится на ваших зубах, оно не так хорошо для ваших образцов.
