Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Здравствуйте, я Хоуп Кэмпбелл, специалист по проточной цитометрии из Института исследований крови при Центре крови штата Висконсин. Здравствуйте, я STR Baso, аспирант в лаборатории доктора Бонни Дитер. Я также работаю в Научно-исследовательском институте крови Центра крови штата Висконсин.

Сегодня мы проведем процедуру изоляции клеток с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток. Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения функции лимфоцитов и популяций миелоидных клеток. Давайте начнем.

При этой процедуре В и CD четыре Т-клетки будут очищены от цитов мыши. Начальное количество целевых ячеек должно быть рассчитано на основе необходимого количества ячеек и скорости восстановления машины с использованием этого метода. Типичная скорость восстановления для В и CD четырех Т-клеток составляет от 85 до 90%. Начальная популяция SP-цитов составляет примерно от 60 до 70% В-клеток и от 20 до 30% Т-клеток.

Таким образом, если вы начнете со 100 умножить на 10 к 6 клеткам, вы сможете восстановить от 50 до 60 миллионов В-клеток и от 20 до 30 миллионов Т-клеток. Растворы и реагенты, необходимые для протокола, должны быть помещены на лед. К ним относятся окрашивающий буфер, состоящий из фосфатно-солевого буфера с 3% фетальной сывороткой теленка, суспензионный буфер, состоящий из 25 миллимолярных ГЭП, приготовленных в сбалансированном солевом растворе Хэнка, или HBSS, содержащий 3% фетальную телячью сыворотку, А, 25 миллимолярный раствор геп В, приготовленный в фетальной сыворотке теленка, окрашивающие антитела и компенсационные гранулы.

Для этого протокола также требуются следующие расходные материалы и реагенты. 15 миллилитровые конические трубки, проточные трубки из полистирола 12 на 75 миллиметров или полипропиленовые проточные трубки. Для этого также следует заранее подготовить капроновое сетчатое фильтр для клеток триен синего цвета, а также гемоцитометр для сортировки пробирок для сбора.

По 300 микролитров раствора HEs FCS на проточные трубки или одного миллилитра раствора HEPs FFC S на 15 миллилитровые конические трубки. Их следует положить на лед до начала процесса сбора. Начните с создания суспензии для одной клетки желаемой популяции клеток.

Если клетки изолированы, то с помощью этой процедуры будет проведена культивация. Вся клеточная подготовка должна быть выполнена в капюшоне для культуры тканей. Используя стерильную технику, промойте клетки один раз, добавив ледяное окрашивание, буфер и резус, подвесив клетки, перевернув трубку несколько раз.

Затем центрифугируйте ячейки в течение семи-восьми минут при температуре около 250 GS и четырех градусах Цельсия. Условия промывки могут варьироваться в зависимости от типа и концентрации клеток. Для цитов промывайте до 200 раз по 10-6 клеток 10 миллилитров красящего буфера.

Осторожно удалите надосадочную жидкость методом аспирации, чтобы клеточная гранула осталась неповрежденной. Затем ресуспендируют клетки в ледяном окрашивающем буфере в концентрации до 50 раз по 10 до шестой на 100 микролитров. Повторно суспендируйте клеточную гранулу, щелкая или осторожно вращая трубку.

Затем перенесите 0,25 в один умножить на 10 из шести ячеек в новую проточную трубку из полистирола или полипропилена размером 12 на 75 миллиметров на льду. Отложите это в сторону, чтобы использовать позже в качестве неокрашенного контрольного образца в первую пробирку, добавьте первичные антитела к клеточной суспензии для достижения желаемой конечной концентрации. Здесь для окрашивания В-клеток используются красные конъюгированные анти-B 20-20 антитела PE Texas, в то время как ZI-конъюгированные анти-TCR R бета-и-700 конъюгированные анти-CD-четыре антитела используются для окрашивания Т-клеток, смешанных при нажатии на дно пробирки или на свету.

Вортексинг затем помещают клетки на лед и инкубируют в темноте от 20 до 30 минут. После инкубации меченые клетки промыть Резусом, суспензив их в 10 миллилитрах ледяной суспензии, буферной и центрифузии, как и раньше, после тщательного удаления надосадочной жидкости. Повторите этот шаг, чтобы промыть ячейки во второй раз.

Наконец, повторно суспендируйте клетки в ледяную суспензию буфера. Если первичные антитела не конъюгированы непосредственно с фторочетверкой, добавьте меченые вторичные антитела или стрептококковый AVID в конъюгате к клеточной суспензии и снова инкубируйте клетки на льду в темноте в течение 20-30 минут после инкубации. Дважды промойте ячейки ледяным суспензионным буфером.

После ресузирования суспензию клеток в ледяной суспензионный буфер. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью жизненно важного красителя, такого как триановый синий и гемоцитометр. Отрегулируйте концентрацию клеток в соотношении от 10 до 20 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр, добавив буфер для суспензии, чтобы избежать засорения факсимильного аппарата кластерами клеток, которые могли погибнуть во время изоляции.

Порядок действий и окрашивание. Отфильтруйте ячейки через капельное ситечко непосредственно перед началом протокола сортировки. Размер пор ситечка следует выбирать в зависимости от типа клеток: для цитов используется ситечко с размером пор 40 мкм.

Соберите отфильтрованные ячейки в коническую трубку объемом 15 литров или проточные трубки размером 12 на 75 миллиметров, в зависимости от объема. И поместите клетки на лед, пока цитометр настроен на процедуру сортировки. При использовании бусин BD в качестве одноцветного положительного контроля подготовьте одну контрольную пробирку для каждого цвета, используемого в анализе, плюс неокрашенную отрицательную контрольную трубку.

После тщательного перемешивания суспензий шариков добавьте по одной, опустите каждую из отрицательных и положительных суспензий шариков в буфер суспензии объемом 100 микролитров для каждого используемого цвета и отрицательного контроля. Далее добавьте по одному микролитру меченого антитела в каждую положительную контрольную пробирку. В этом эксперименте одна пробирка готовится с использованием двух антител PE Texas'Red B 20.

Один с использованием подходящих бета-антител ETCR и один с использованием lor 700 CD четыре антитела смешивают путем перелистывания дна пробирок и инкубируют в течение 15-30 минут в темноте при комнатной температуре. Промойте шарики один раз двумя миллилитрами красителя, буфером и центрифугой при 200 G в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость путем аспирации и повторно суспендируйте гранулу в 200-500 микролитрах окрашивания.

Настройка буфера проточного цитометра варьируется в зависимости от производителя и должна выполняться только соответствующим образом обученным персоналом. Процедура сортировки клеток здесь будет выполняться с использованием дефектов BD aria. Перед сортировкой выберите подходящую форсунку в зависимости от типа сортируемой ячейки.

Доступные размеры для арии фактов составляют 70 микрометров, 100 микрометров и 130 микрометров. Размер насадки должен быть как минимум в три раза больше размера клетки, подлежащей сортировке на лимфоциты, выбирается насадка 70 мкм. Асептическая сортировка клеток может быть выполнена с помощью опции асептической сортировки прибора.

При использовании этой опции весь путь оболочки обеззараживается 70%-ным этанолом в соответствии с инструкциями производителя. Обязательно замените фильтры оболочки и замените PBS на стерильные PBS. Когда цитометр будет готов к работе, поместите предварительно охлажденные пробирки для сбора, содержащие кучи FCS, в соответствующее устройство для сбора.

Имеющиеся устройства для сбора могут вместить до двух конических пробирок объемом 15 миллилитров. Четыре трубки размером 12 на 75 миллиметров или четыре микротрубки. Используйте пробирки 12 на 75 миллиметров для сбора менее чем в 1,5 раза по 10 до шестой клетки и 15 миллилитровые конические трубки для сбора от 1,5 до 10 до шести до 4,5 умножить на 10 до шести клеток.

Поместите соответствующее сборное устройство в камеру сбора сортировки. Направьте боковые потоки в установленное устройство сбора для многоцветной сортировки. Сначала цитометр калибруется с учетом спектрального перекрытия между детекторами.

Показанный здесь пример иллюстрирует перекрытие спектров излучения аппроксимации E и pe. Это перекрытие, показанное в темной затененной области, называется переливом. В этом случае переток ПЭ будет обнаружен в канале подгонки E, а перелив подгонки e будет обнаружен в канале ПЭ.

Этот переток должен быть скорректирован, чтобы устранить остаточную флуоресценцию одного четвертого этажа в другом канале. Процесс коррекции побочных эффектов называется компенсацией для выполнения ручной компенсации. Используйте программное обеспечение для цитометрии для создания шаблона, который включает в себя двумерный график для отображения FSC прямого рассеяния и SSC бокового рассеяния, а также одну гистограмму для каждого используемого флурографика.

Метод настройки этих графиков зависит от программного обеспечения. Поместите пробирку с отрицательным контрольным сигналом в загрузочное отверстие цитометра и начните сбор данных во время работы образца. Скорректируйте FSC и SSC в соответствии с масштабом интересующей населения.

Затем отрегулируйте параметры флуоресцентной ФЭУ таким образом, чтобы поместить отрицательную популяцию или автофлуоресценцию в крайнюю левую часть гистограммы. Запишите отрицательную контрольную трубку. Извлеките отрицательную контрольную трубку из загрузочного порта цитометра и замените ее первой положительной контрольной пробиркой.

Теперь приступайте к приобретению. Повторите этот процесс для каждой из положительных контрольных трубок, записывая данные для каждой трубки. Для каждого положительного контроля нарисуйте интервальный вентиль или прямоугольник вокруг событий, записанных на гистограмме.

Затем нарисуйте еще один интервальный вентиль в отрицательной части гистограммы. Выполняя ручную компенсацию, учитывайте каждый флурос, используемый в эксперименте, корректируя медиану положительных результатов до тех пор, пока она не станет равной медиане отрицательных. Чтобы настроить медиану, отрегулируйте значения спектрального перекрытия, вверх или ниже, пока медианы для каждого флуоресцентного параметра не совпадут как можно точнее.

Используя настройки, установленные с положительным и отрицательным контрольными образцами, подготовиться к процедуре сортировки, определив настройки походки для экспериментального образца. Поместите трубку с клетками, которые нужно отсортировать, в порт загрузки цитометра и начните сбор со скоростью от 9 до 10 000 событий в секунду. Выберите точечную диаграмму для отображения прямого разброса по сравнению с боковым разбросом.

Прямое рассеивание является общим индикатором размера ячейки и размещается на оси x, в то время как боковое рассеивание является индикатором зернистости ячеек и размещается на оси Y. Теперь определите интересующее население. После того, как затворы были определены, убедитесь, что температура загрузочного порта цитометра установлена на уровне четырех градусов Цельсия.

Затем поместите пробирку с экспериментальным образцом в загрузочное отверстие. Нажмите опцию сортировки и начните сбор пробирок для сбора следует помещать на лед по мере их заполнения. Продолжайте сортировку до тех пор, пока не будет собрано нужное количество клеток или пока пробирка с образцом не опустеет.

Затем остановите сортировку, снова нажав кнопку сортировки, и извлеките образец из порта загрузки. Затем поместите пробирку для сбора непосредственно на загрузочное отверстие цитометра и получите от 500 до 1000 событий. Используя те же настройки, которые используются для сортировки для Т-клеток, процедура сортировки увеличила чистоту с 21 до 99%. Для В-клеток начальная популяция В-клеток 5% была увеличена до 98% после сортировки.

Итак, мы только что показали вам, как очистить популяцию В- и Т-клеток из цитов с помощью факса. Помните, что факты могут быть использованы для очистки любой клеточной популяции, если может быть получена суспензия одиночных клеток и доступны соответствующие антитела. Кроме того, клетки, генетически стекающиеся с флуоресцентными маркерами, могут быть легко очищены без использования антител.

Кроме того, всегда помните об использовании правильных элементов управления для ваших экспериментов и всегда проверяйте конфигурацию лазера проточной цитометрии, чтобы убедиться, что вы используете правильные флуорохромы, и убедитесь, что вы используете соответствующие ворота, чтобы они правильно располагались вокруг вашей популяции. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в Ваших экспериментах.