Система двойной экспрессии на основе комплементации GFP для оценки межклеточного контакта, опосредованного цитонемами в имагинальных дисках крыльев живой дрозофилы

Таким образом, наше исследование сосредоточено на понимании того, как удаленные клетки в тканях взаимодействуют друг с другом. Мы используем имагинальный диск крыльев дрозофилы в качестве модельной системы, чтобы попытаться понять, как образуются цитидины, как они функционируют и какую роль они играют в локальном контроле роста тканей. Исследования показывают, что факторы роста часто перемещаются через специализированные клеточные проекции, такие как сигнальные филоподии на основе актина, называемые цитонемами, чтобы быть доставленными к клеткам-мишеням.

Цитонемы представляют собой очень тонкие и хрупкие структуры, которые легко разрушаются по протоколу фиксации. Чтобы наблюдать за ними, необходимо использовать специальные подходы к визуализации в реальном времени с экспрессированным флуоресцентно меченным белком. Это сильно ограничивает инструменты и подходы, которые мы можем использовать для их исследования.

Мы идентифицировали протеинкиназу под названием Slik, которая участвует в биогенезе цитонемы. Экспрессия Slik в одном эпидуральном слое в имагинальном диске крыла запускает образование цитонемы, которая пересекает просвет диска и стимулирует пролиферацию клеток в соседнем эпителиальном слое. В будущем мы хотели бы идентифицировать белок, действующий после Slik и способствующий образованию цитонемы, идентифицировать лиганд, который доставляется через эту цитонему для стимулирования перфорации, и лучше понять физиологическую важность этого механизма в контроле роста тканей.

Для начала вырежьте ножницами отдельные лунки из восьмилуночной полосы, а затем разрежьте каждую лунку пополам. Снимите защитную подложку с одной стороны каждой половины и наклейте распорки на предметное стекло микроскопа, слегка расставив их друг от друга, чтобы создать защищенное центральное пространство для размещения диска. Выберите блуждающих личинок третьего возраста из трубки для выращивания после генетического скрещивания и инкубации при температуре 25 градусов Цельсия.

Под препарирующим микроскопом перенесите личинки в каплю живой среды визуализации на чашке Петри, покрытой силиконом. Используя два рассекающих щипца, начните рассечение, зажав личинки примерно на 1/3 длины тела от передней части одной парой щипцов, чтобы удерживать ее устойчиво. Со второй парой сожмите тело чуть кзади к первой точке и потяните, чтобы отделить заднюю половину, изолировав передний отдел.

Переверните переднюю половину, взявшись пинцетом за обе стороны разреза и протолкнув головку с помощью второй пары, вывернув ее наизнанку. При этом обнажаются внутренние структуры, такие как имагинальные диски, трахея, слюнные железы, жировое тело и кишечник. Удалите слюнные железы, жировое тело и кишечник с помощью щипцов, стараясь не повредить боковые стволы трахеи, расположенные над дисками крыльев.

С помощью щипцов перенесите очищенные передние половинки с прикрепленными барашковыми дисками в каплю чистой рабочей среды для визуализации с крючками, помещенными между прокладками слайдов. Чтобы изолировать диски крыльев, аккуратно рассеките их от тонких ветвей трахеи с помощью одного лезвия рассекающего щипца или тонкой вольфрамовой проволоки, установленной на иглодержателе для рассечения. Оставшуюся тушку выбросить.

Сориентируйте диски крыльев с помощью препарирующего щипца, лезвия или вольфрамовой иглы так, чтобы сторона периподиальной мембраны была обращена вверх. Отрегулируйте средний объем так, чтобы он немного переполнял лунку над уровнем распорки. Снимите верхнюю защитную подложку с прокладки для визуализации и осторожно опустите на образец защитную крышку.

Прижмите чехол к точкам контакта распорки с помощью закругленного конца щипцов, чтобы обеспечить надлежащую адгезию. Чтобы спроецировать стеки изображений в ImageJ, выберите «Изображение», затем «Стеки», а затем «Z-проект» и выберите в меню «Максимальная интенсивность». На изображениях проекции максимальной интенсивности определите область крыльевого мешка на основе схемы складывания диска крыла с помощью канала крючков и инструмента выбора полигона.

Примените то же выделение к каналу GFP и выберите «Редактировать», а затем «Очистить снаружи», чтобы устранить шум за пределами выбранной области. Используйте канал крючков в изображениях проекции максимальной интенсивности, чтобы определить артефактные пятна на изображениях GFP. Затем выделите область с помощью инструмента выделения полигона.

Нажмите «Редактировать» и выберите «Очистить». В очищенных проекционных изображениях максимальной интенсивности выберите «Анализ», затем «Гистограмма» и выберите «Список», чтобы получить все значения в пикселях. Скопируйте этот список в таблицу электронной таблицы.

Чтобы установить пороговое значение, проанализируйте фоновый сигнал в отрицательных контрольных образцах и подтвердите это значение с помощью других образцов изображений. Вычислите процент GFP-положительной поверхности, разделив количество пикселей выше порогового значения на общее число допустимых пикселей и умножив результат на 100. Наконец, нормализуйте каждое вычисленное значение после деления его на среднее значение эталонного условия, которое установлено равным единице.

В дисках дикого типа, в которых отсутствовали обе разделенные компоненты GFP, вблизи центра крыльевого мешка наблюдалась лишь минимальная гранулярная автофлуоресценция GFP, и этот базовый сигнал использовался для определения порога флуоресценции. Диски, экспрессирующие только расщепленный CD4 GFP1-10 в собственном слое диска, показали уровни флуоресценции, неотличимые от дикого типа, что подтверждает только нефлуоресцентную природу GFP1-10. Коэкспрессия расщепленного CD4 GFP1-10 в самом диске и CD4spGFP11 в периподиальной мембране привела к заметному увеличению дискретных, ярких пятен GFP, локализованных в просвете диска, со значительно большей положительной флуоресценцией выше порога, чем в контрольной группе.

Экспрессия Slik в самом диске вызывала сильное увеличение плотности ядер периподиальной мембраны и резкое увеличение интенсивности сигнала GFP в области крыльевого мешка, что позволяет предположить, что цитонемы, индуцированные Slik, устанавливают усиленный контакт с клетками периподиальной мембраны.