Изоляция стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного

Общая цель этой процедуры заключается в выделении взрослых стволовых клеток из мягких тканей опорно-двигательного аппарата, таких как скелетные мышцы. Это достигается путем предварительного взятия биопсии мягких тканей, удаления их и мелкого измельчения. Вторым этапом процедуры является ферментативное переваривание тканей.

Третьим этапом процедуры является выделение стволовых клеток с помощью повторяющихся этапов предварительного осаждения. Заключительным этапом процедуры является идентификация выделенных стволовых клеток. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают морфологическое и клеточное поведение клеток с помощью иммунофлуоресценции, микроскопии и/или проточной цитометрии.

Здравствуйте, меня зовут Ли из лаборатории молекулярной патологии на кафедре ортопедической хирургии Университета Питтсбурга. Сегодня я покажу вам, как выделить взрослую стволовую клетку из мягких тканей скелетной системы, таких как скелетные мышцы. Здравствуйте, я доктор Джонни Уорд.

Я являюсь профессором Медицинской школы Университета Питтсбурга на кафедре ортопедической хирургии. Я тесно сотрудничаю с доктором Янг Ли и этими процедурами по изоляции различных типов стволовых клеток из скелетных мышц и изменению тканей, таких как стандартные. Мы используем процедуры в нашей лаборатории для выделения стволовых клеток в основном для научных исследований в области трансляционной медицины.

Итак, давайте изучать. К тканям, из которых можно выделить стволовые клетки, относятся сухожилия и скелетные мышцы, собранные из большеберцовой кости или камбаловидных мышц задней конечности мышей дикого типа. После удаления остатков кожи и костей поместите салфетки в чашку с холодным HBSS с добавлением 5% FBS.

Далее поместите ткань отдельно на посуду, покрытую коллагеном, содержащую холодный HBSS. Мы будем использовать ткани скелетных мышц, чтобы продемонстрировать основные процедуры диссоциации тканей и пищеварения. Используйте микроножницы и/или лезвия скальпеля, чтобы измельчить скелетные ткани в грубую кашицу для ферментативного переваривания тканей.

Начните с переноса тканевых суспензий MIT в отдельные 15-миллилитровые пробирки в центрифуге со скоростью примерно 3500 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите смывку SANE с помощью Resus, суспензив HBSS, и повторите центрифугирование. После удаления надната переварите кашицу, добавив 10 миллилитров предварительно подогретой 0,2% коллагеназы.

Тип 11 инкубируют в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая трубки вручную каждые 10 минут после завершения 60-минутной инкубации. Центрифугируйте и затем повторно суспендируйте суспензии в 10 миллилитрах раствора DYS. Инкубировать в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая вручную каждые 10 минут после 45-минутной инкубационной центрифуги, и суспендировать суспензию в 10 миллилитрах 0,2% трипса в растворе HBSS.

Обычно мы инкубируем от 15 до 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия, переворачивая трубки каждые 10 минут, инкубация завершена. Когда из тканей высвобождается достаточное количество отдельных клеток, как показано здесь, центрифугируйте полученные клетки и суспензируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах пролиферации. Средние PM диссоциируют клеточную суспензию путем пропускания экстракта через ряд игл два раза через иглу 18 калибра, затем один раз через иглу 23 калибра и, наконец, один раз через иглу 27 калибра.

Наконец, пропустите клеточный экстракт через клеточный фильтр 70 микрон, чтобы начать технику prepl. Центрифугируйте только что приготовленный клеточный экстракт и повторно суспендируйте гранулы в процессе пролиферации. Средний слой пяти миллилитров клеточной смеси положите в колбу с коллагеновым покрытием T 25 и продайте как PP One, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение двух часов.

Через два часа. Перенесите неадгезивные клетки в новую колбу с коллагеновым покрытием T 25 и продавайте ее как PP 2. Добавьте пять миллилитров PM в предыдущую колбу T 25 с маркировкой PP one.

Верните обе колбы в инкубатор на 24 часа. Через 24 часа перенесите неадгезивные клетки из PP 2 в новую колбу с коллагеновым покрытием ENC T 25 и пометьте ее как PP 3. Добавьте пять миллилитров пролиферативной среды в колбу с маркировкой ПП два.

Верните колбы в инкубатор. Повторяйте процедуру каждые 24 часа до популяции ПП шесть. Создается популяция стволовых клеток.

Выделенные шесть клеток PP очень немногочисленны и нуждаются в поддержании в пролиферативной среде, богатой FBS. Ситуация меняется каждый день. Хотя большинство клеток в культуре PP six погибнут в течение следующих одной-двух недель культивирования.

Большая здоровая популяция PP 6 обычно создается после дополнительной одной-двух недель расширения. Поддерживайте и все другие группы взвешенных клеток, позволяя им размножаться и регулярно исследуя их с помощью инвертированного микроскопа. Ранние адгезивные клетки, которые прикрепляются к опциям PP One и PP 2, в основном являются фиброзными клетками.

Клетки, которые прилипают к колбам, покрытым коллагеном, через более длительный период времени в течение 48-96 часов. PP 3 и PP 4 в основном являются миобластами. В то время как мышечные сателлитные клетки часто наблюдаются в основном в PP 5, более поздние клетки prepl через 96 часов или позже PP 6 рассматриваются как взрослые стволовые клетки и выглядят маленькими, круглыми и полупрозрачными.

В начале их выделения они могут быть дополнительно охарактеризованы иммуногистохимическим методом на предмет экспрессии маркеров стволовых клеток, таких как стволовые клетки, антиген 1 и CDC 34. Мы только что показали вам, как выделить стволовую клетку из второй массы мыши. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости поддерживать стероиды во время всех процедур.

После того, как стволовые клетки были выделены, обязательно культивируйте эти клетки с низкой плотностью, чтобы сохранить характеристики стволовых клеток клеток. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи с вашим опытом И желаю вам удачи попробовать использовать это в своем эксперименте.

Спасибо.