С. elegans Рассечение бластомеров: метод удаления яичной скорлупы и диссоциации эмбриональных клеток

- Для этого вскрытия используйте две микропипетки: одну с отверстием примерно такой же ширины, как у яйца, и другую, которая в два раза шире, а также ряд растворов, организованных в лунки для облегчения быстрого переноса между ними.

Сначала поместите взрослых гермафродитов в раствор яичной соли, который осмотически сбалансирован, чтобы предотвратить разрыв эмбрионов. Разрежьте червей пополам, чтобы освободить развивающиеся эмбрионы.

Затем определите эмбрионы двухклеточной стадии. Эти клетки представляют собой бластомеры, образующиеся в результате деления оплодотворенной яйцеклетки. С помощью микропипетки с большим отверстием перенесите эмбрион в раствор гипохлорита, отбеливателя, который начнет разрушать защитную яичную скорлупу.

Через 40-55 секунд перенесите эмбрион в питательную среду Шелтона, или SGM. Кратко промойте каждый эмбрион в двух лунках SGM, чтобы удалить все следы отбеливателя, прежде чем поместить их в третью лунку.

Теперь используйте меньшую микропипетку для многократного пипетирования эмбриона, обеспечивая механическую силу для удаления яичной скорлупы и обнажения бластомеров. Аккуратно продолжайте пипетировать эмбрион, чтобы отделить отдельные клетки бластомера. В следующем протоколе мы увидим эту технику в действии.

- Придерживайте каждый конец микрокапилляра в емкости 10 микролитров правой и левой рукой. Потяните микрокапилляр к обоим концам, чтобы натянуть, и переместите центр капилляра над горелкой, чтобы получился два капилляра, вытянутых вручную.

Под препарирующим микроскопом обрежьте кончики натянутых рукой капилляров щипцами. Сделайте два размера отверстия кончика примерно в два раза и в один раз больше длины короткой оси эмбрионов C. elegans для переноса эмбрионов и удаления яичной скорлупы соответственно.

Присоедините вытянутый капилляр к ротовому пипетирующему аппарату. Пипеткой нанесите 45 микролитров раствора яичной соли на лунку многолуночного предметного стекла.

Поместите в лунку от 5 до 10 взрослых особей C. elegans. Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрежьте взрослых особей на части, расположив две иглы справа и слева от тела C. elegans и проведя иглы друг мимо друга.

Пипеткой нанесите 45 микролитров раствора гипохлорита в лунку рядом с лункой, содержащей раствор яичной соли, и пипеткой 45 микролитров питательной среды Шелтона в последующие три лунки. Перенесите эмбрионы одноклеточной стадии и ранней двухклеточной стадии в раствор гипохорита с помощью ротовой пипетки с отверстием большего размера и подождите от 40 до 55 секунд.

Промойте зародыши, перенеся их в следующие три лунки со средой для выращивания Шелтона на 1-2 секунды в каждую из первых двух лунок. С помощью нарисованного от руки капилляра с меньшим по размеру отверстием осторожно повторите пипетирование эмбриона для удаления яичной скорлупы.

После этого непрерывно пипетируйте нарисованным вручную капилляром, чтобы отделить двухклеточные эмбриональные бластомеры.

- После удаления яичной скорлупы сведите к минимуму усилие пипетирования эмбрионов вверх и вниз, чтобы предотвратить разрыв.