Electroeluting фрагментов ДНК

Здравствуйте. Сегодня мы покажем вам, как проводится электроэлюция для очистки фрагментов ДНК, таких как продукты рестрикции и ПЦР. Для дальнейших целей, например, клонирования и секвенирования, электроэлюция может стать одним из предпочтительных методов. Основываясь на отрицательном электрическом заряде ДНК, в электрическом поле устанавливается высокий клеточный барьер, что приводит к осаждению фрагментов и предотвращает их дальнейшую миграцию.

Данный метод позволяет очищать широкий диапазон размеров фрагментов ДНК из различных источников с относительно высокой эффективностью — до 80%. Низкая стоимость является еще одним преимуществом электроэлюции по сравнению с другими методами очистки, такими как колонки, наборы с использованием смол и другие. Сначала образец ДНК визуализируют с помощью электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием, чтобы увидеть и идентифицировать необходимый очищаемый фрагмент; после этого следует провести электрофорез.

При хорошем разделении фрагментов можно точно определить недоразмерные части. После электрофореза искомый фрагмент аккуратно вырезают из геля с помощью нового лезвия бритвы, стараясь максимально точно обрезать срез геля по границам интересующей полосы.

Данную процедуру следует проводить с надлежащей защитой от УФ-излучения и в перчатках. После заполнения электроэлютора соответствующим буфером для элюции и аккуратного распределения его по поверхности центрального плато, фрагмент геля помещают в одно из колец максимально близко к V-образному каналу. Внутри V-образного канала не должно быть пузырьков воздуха.

Этого можно избежать, промыв канал буфером для удаления пузырьков воздуха. Затем в V-канал со стороны, прилегающей к лунке, осторожно добавляют 100 µL высокосолевого барьера. Камеру закрывают, а электроды подключают к источнику питания, чтобы начать электролюцию при напряжении от 100 до 120 вольт.

Время ожидания будет зависеть от размера фрагмента: для крупных фрагментов размером до 20 kb должно быть достаточно от 50 минут до одного часа, а за состоянием малых фрагментов следует наблюдать каждые 10 минут с помощью УФ-света, чтобы предотвратить дальнейшее вымывание через солевой раствор в конечный буфер сбора. В данном случае мы переварили 560 нг плазмиды ферментами ND one и entry для высвобождения фрагмента размером 900 bp, что эквивалентно 84 нг образца.

Соответственно, после помещения среза геля в лунку электроэлюцию проводят в течение 25 минут при 100 В. После завершения электроэлюции, когда фрагменты ДНК окажутся в нижней подушке внутри V-образного канала, из канала с дистальной стороны приемника извлекают 400 µL раствора и переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мкл с помощью микропипетки с тонким наконечником. Далее проводят осаждение спиртом, добавляя два объема холодного абсолютного этанола и перемешивая на вортексе. Кроме того, для повышения выхода рекуперированной ДНК можно добавить 2–3 µL гликогена. Пробирки выдерживают при -20 °C в течение одного часа или, в качестве альтернативы, хранят при этой температуре в течение ночи, после чего центрифугируют при 4 °C на максимальной скорости в течение 25 минут.

Отбросьте супернатант и промойте осадок, добавив 1 мл холодного 70% этанола. Центрифугируйте при 4 °C на максимальной скорости в течение 5–10 минут, слейте супернатант и дайте осадку высохнуть при комнатной температуре, перевернув пробирки. Ресуспендируйте осадок в 10–15 µL свободной от нуклеаз воды и приступайте к определению концентрации образца. В данном случае очищенный образец был ресуспендирован в 10 µL воды и количественно определен с помощью спектрофотометра при длине волны 260 нм, что показало концентрацию 6,3 нг/µL, что соответствует эффективности 75%. Возможно, вы подумаете, что было бы целесообразнее потратить всего 10 минут вашего драгоценного времени, используя готовый набор.

Тем не менее, несмотря на временные затраты в этом процессе, вы сможете контролировать многие переменные, что позволит вам очищать более широкий спектр образцов с различными размерами и из разных источников. Как вы могли видеть в данном случае, эффективность составила 75%, что сопоставимо или выше показателей большинства наборов для очистки ДНК. Благодарим вас за участие.

Надеемся, что данный протокол окажется полезным для ваших исследовательских проектов.