Electroeluting фрагментов ДНК

Hi.Today мы покажем вам, как проводится электролюция для очистки фрагментов ДНК, таких как продукты пищеварения и ПЦР. Для других целей, таких как клонирование и секвенирование, электролюция может быть одним из методов выбора. Основываясь на отрицательном электрическом заряде ДНК, высокий клеточный барьер помещается в электрополе, отбрасывая фрагменты и предотвращая их дальнейшую миграцию.

Этот метод позволяет проводить очистку фрагментов ДНК в широком диапазоне размеров из разных источников с относительно высокой эффективностью до 80% при его низкой стоимости. Представляют собой еще одно преимущество электролюции по сравнению с другими методами очистки, такими как колонки, наборы смол и другие. Образец ДНК сначала визуализируется с помощью электрофореза в геле Aris, окрашенного бромидом скуки, чтобы визуализировать и идентифицировать желаемый фрагмент, подлежащий очистке, следует продолжить электрофорез.

Нижние осколки хорошо отделяются, недомеры можно точно определить. После электрофореза. Нужный фрагмент аккуратно вырезается из геля с помощью новенького бритвенного лезвия и старается повернуть срез геля как можно ближе к интересующей полосе.

Эта процедура должна выполняться при надлежащей защите от ультрафиолета и в перчатках. После заполнения электролютера буфером для горения Appropriate burn и заботясь о том, чтобы пролить его по поверхности среднего плато, гелевый срез помещается внутрь одного из колес как можно ближе к V-образному каналу. Внутри канала vch не должно быть пузырей.

Этого можно избежать, промыв канал буфером для удаления захваченного воздуха. Затем 100 микролитров высокого солевого барьера аккуратно добавляются в V-образный канал от участка, расположенного проксимальнее скважины. Камера закрыта, и электроды подключаются к источнику питания, чтобы начать электроснабжение при напряжении от 100 до 120 вольт.

Временной интервал будет зависеть от размера фрагмента для больших фрагментов размером до 20 кбит/с. От 50 минут до одного часа должно быть достаточно, и небольшие фрагменты должны контролироваться каждые 10 минут ультрафиолетовым светом, чтобы избежать дальнейшего элиона через раствор соли и попадания в конечную взрослую буферную цепь. В этом случае мы переварили 560 нанограммов плазмиды с ферментом ND и входом для высвобождения 900 оснований на фрагмент, что эквивалентно 84 нанограммам образца.

Соответственно, после помещения гелевого среза внутрь лунки, электролюция будет протекать в течение 25 минут при напряжении 100 вольт. После того, как электрораствор завершен и фрагменты ДНК захвачены в южной подушке внутри V-образного канала, 400 микролитров раствора извлекаются из канала, с дистальной стороны емкости и помещаются в микропробирку объемом 1,5 микролитра с помощью тонкого наконечника, прикрепленного к микроямке, приступают к осаждению алкоголя, добавляя два объема холодного абсолютного этанола и перемешивая вихрем. Кроме того, можно добавить от двух до трех микролитров гликогена для улучшения выхода классических пробирок для восстановления ДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение одного часа или, в качестве альтернативы, хранить при этой температуре в течение ночи в центрифуге при температуре четыре градуса Цельсия на максимальной скорости в течение 25 минут.

Это кардионадосадочная жидкость и промыть, добавив один миллилитр холодной, 70%-ной этаноловой центрифуги при температуре четыре градуса Цельсия на максимальной скорости в течение пяти-10 минут, выбросить надосадочную жидкость и дать ей высохнуть при комнатной температуре с трубками в перевернутом положении, смазать от 10 до 15 микролитров свободного ядра воды и приступить к определению концентрации образца. В этом случае очищенный образец был суспендирован в 10 микролитрах воды и количественно определен в спектрофотометре на длине волны 260 нанометров, показав концентрацию 6,3 нанограмма на микролитр, что составляет 75% эффективности. Возможно, вы думаете, что было бы лучше потратить всего 10 минут своего драгоценного времени на комплект.

Однако, несмотря на время, затраченное на этот процесс, вы сможете контролировать многие переменные, что позволит вам очищать более широкий спектр образцов, имеющих природные размеры и источники. Как вы могли видеть в данном случае, эффективность в 75% была равна или выше, чем у большинства наборов для очистки ДНК. Спасибо, что присоединились к нам сегодня.

Мы надеемся, что вы нашли этот протокол полезным для ваших исследовательских проектов.