Метод аффинитной хроматографии для очистки рекомбинантного бактериального белка

Возьмём суспензию бактериальных клеток, экспрессирующих белок с полигистидином.

Соник на льду, чтобы минимизировать разрушение белка. Высокочастотные звуковые волны лизируют клетки, высвобождая внутриклеточный содержимое, включая целевой белок.

Центрифуга для отделения мусора и переноса белков, содержащих супернатант, в шприц.

Фильтруйте супернатант, чтобы удалить заполнители и предотвратить закупорку хроматографической колонки.

Возьмите колонку аффинной хроматографии на основе никеля и уравновесьте её для оптимальной очистки белка.

Загрузите фильтрат на колонну. Метка полигистидина связывается с ионами никеля на колонной смоле, обездвиживая целевые белки.

Промыйте колонку буфером для удаления несвязанных белков и следите за ультрафиолетовым поглощением элуата, чтобы подтвердить их удаление нецелевых белков.

Добавьте элюсионный буфер, содержащий имидазол, который конкурирует с меткой полигистидина для связывания никеля, высвобождая белки.

Второй скачок поглощения УФ-излучения подтверждает элюирование целевого белка, который готов к дальнейшему использованию.

Соникуйте клетки на льду, используя пять циклов по 15-секундному импульсу и 30-секундной паузе.

После центрифугирования лизата клетки при 21 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 15 минут фильтруйте супернатант с помощью стерильной системы фильтрации шприца. Используйте автоматизированную систему очистки, оснащённую пятимиллилитровым никелевым афинитетным столбцом для очистки HIS-метированной фракции RTA из стерильно фильтрованного супернатанта E.coli . В целом используйте скорость разведения в один миллилитр в минуту и охлаждайте всю систему очистки, чтобы предотвратить неэффективное связывание токсинов и их потерю.

Кратко уравновесьте колонку аффинности с помощью 20 миллилитров буфера связывания, чтобы удалить буфер хранения. Затем нанесите стерильный, фильтрованный супернатант на колонку аффинитета с помощью шприца. Промыйте колонку 25–35 миллилитрами связывающего буфера, чтобы удалить несвязанные белки из колонки.

Выполняйте этап промывания, пока поглощение УФ-излучения при 280 нанометров не приблизится к начальному значению УФ. Затем элюируйте связанную фракцию RTA с помощью 20–35 миллилитров буфера элюции и храните образец на льду. Важно начать отбор фракции RTA вскоре после повышения значения UV 280 и прекратить отбор фракции RTA, когда он снова достигнет исходной базовой линии.