Очистка самоорганизующихся белковых наночастиц с помощью аффинной хроматографии

Возьмем суспензию сконструированных бактерий, экспрессирующих рекомбинантные самоорганизующиеся белковые наночастицы с полигистидиновыми метками.

Ультразвуком высвобождают внутриклеточные компоненты.

Центрифуга для сбора надосадочной жидкости, содержащей белковые наночастицы. Разбавьте его буфером, не содержащим имидазола.

Возьмем колонку аффинной хроматографии, содержащую шарики агарозы с иммобилизованными катионами никеля.

Добавьте буфер с низкой концентрацией имидазола для уравновешивания колонок.

Добавьте бактериальный лизат на колонку.

Во время прогона полигистидин на белковых наночастицах прочно связывается с катионами никеля.

Между тем, такие загрязнители, как бактериальные липополисахариды и другие белки, слабо связываются с колонкой.

Промойте буфером, содержащим низкую концентрацию имидазола, чтобы удалить слабо связанные белки.

Введите изопропанол для удаления липополисахаридов и затем промыте.

Далее вводят буфер с промежуточной концентрацией имидазола. Имидазол конкурирует с гистидином за связывание с катионом никеля, высвобождая связанные белковые наночастицы.

Затем добавьте буфер, содержащий высокую концентрацию имидазола, чтобы полностью вымыть белковые наночастицы.

Соберите очищенные наночастицы белка для дальнейшего нанесения.

Для лизиса собранной E. coli, экспрессирующей пучок с шестью спиралями SAPN, используйте зонд с выходной мощностью ультразвука 150 Вт, с четырьмя секундами обработки ультразвуком и шестью секундами отдыха для обработки ультразвуком ресуспендированных бактериальных гранул в 40 миллилитрах буфера, не содержащего имидазола, на льду в течение пяти минут.

Центрифугируйте клеточный лизат для получения осветленной надосадочной жидкости и переложите надосадочную жидкость в стерильную колбу объемом 150 миллилитров. Затем доведите образец до конечного объема в 100 миллилитров с помощью свежего буфера, не содержащего имидазола.

Чтобы выделить интересующий вас белок, откройте программное обеспечение FPLC и выберите опцию «Новый метод». В меню «Настройки метода» откройте раскрывающееся меню «Положение столбца» и выберите C1 Port 3. В раскрывающемся меню «Показано по технике» выберите «Сходство». В раскрывающемся меню «Тип столбца» выберите «Другие», «HisTrap HP» и «пять миллилитров». Объем колонны и напорные блоки будут автоматически установлены на соответствующие значения.

Нажмите «Контур метода» и перетащите кнопки «Уравновешивание» и «Применение образца», три кнопки «Размытие столбцов» и кнопку «Элюирование» из всплывающего меню «Библиотека фаз» рядом со стрелкой, прежде чем закрыть меню «Библиотека фаз». Нажмите кнопку Уравновешивание и установите значения, перечисленные в таблице, на Начальный буфер B, 4%, Конечный буфер B, 4% и Объем столбца, 5.

Нажмите кнопку Образец приложения. В поле Sample Load (Загрузка пробы) нажмите переключатель Inject Sample on Column with Sample Pump (Инжекция пробы на колонне с насосом для проб) и убедитесь, что флажок рядом с параметром Use Flow Rate From Method Settings (Использовать расход из метода отмечен) установлен в поле Sample Injection (Закачка пробы) с системным насосным блоком. Измените значение поля Объем на 100 миллилитров, а для параметра Схема сбора дробей — значение Включить.

Снимите флажок «Использовать размер дроби» в настройках метода и измените размер дроби на четыре миллилитра. Нажмите на первую кнопку «Промывка столбца». Задайте значения, перечисленные в таблице, в следующих значениях: Начальный буфер B, 4%, Конечный буфер B, 4% и Объем столбца, 10. Щёлкните по окошку Включить схему сбора дробей и снимите флажок Использовать размер дроби для настроек метода. Измените размер фракции на четыре миллилитра и нажмите вторую кнопку «Промывка столбца».

Установите в таблице следующие значения: Начальный буфер B, 0%, Конечный буфер B, 0% и Объем столбца, 5. Щёлкните по окошку Включить схему сбора дробей и снимите флажок Использовать размер дроби в настройках метода. Измените размер фракции на 4 миллилитра и нажмите кнопку «Промывка в третьем столбце». Установите в таблице следующие значения: Начальный буфер B, 0%, Конечный буфер B, 0% и Объем столбца, 10. Нажмите кнопку Включить схему сбора дробей и снимите флажок Использовать размер дроби для настроек метода. Затем измените размер фракции на 4 миллилитра.

Нажмите кнопку «Элюирование» и щелкните правой кнопкой мыши информацию в таблице. Во всплывающем меню нажмите «Удалить шаг» и дважды перетащите кнопку «Изократический градиент» на таблицу, чтобы получилось два элемента. Установите значение для первой записи на Начальный буфер B, 30%, Конечный буфер B, 30% и Объем столбца, 10.

Установите значение для второй записи в Начальный буфер B, 100%, Конечный буфер B, 100%, и объем столбца, 10. Нажмите кнопку Включить схему сбора дробей и выберите окно Использовать размер дроби для настроек метода. Затем нажмите «Сохранить как» и назовите файл «Очищение».

Поместите трубку насоса А FPLC в буфер для промывки, не содержащий имидазола, а трубку насоса В — в 500-миллимолярный буфер имидазола. Поместите трубку насоса для отбора проб в образец объемом 100 миллилитров и запустите программу очистки. Когда потребуется промывка с 60% изопропанолом, приостановите программу, переместите трубку насоса из промывки без имидазола в промывку с 60% изопропанолом и снова запустите программу. По окончании промывки снова приостановите программу, верните трубку насоса А в буфер для промывки, не содержащий имидазола, и перезапустите программу очистки.