Количественная оценка дцДНК использованием Hitachi F-7000 Флуоресцентный спектрофотометр и PicoGreen Dye

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать способность флуоресцентного спектрофотометра F 7 000 со считывателем микропланшетов выполнять количественное определение двухцепочечной ДНК с использованием зеленого красителя Pico. Это достигается путем предварительной подготовки образцов и реагентов. Вторым этапом процедуры является настройка инструмента.

Третьим этапом процедуры является загрузка образцов в считыватель Microplate. Заключительным этапом процедуры является выполнение измерения стандартов и образцов. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие линейную калибровочную кривую, которая может быть использована для количественного определения двухцепочечной ДНК неизвестных образцов.

Включите флуориметр Hitachi F 7, 000 Spectra, чтобы ксеноновая лампа прогрелась в течение одного часа в программе Excel. Создайте файл со стандартами и образцами данных и сохраните его в значениях, разделенных запятыми, или в формате CSV. Чтобы сначала настроить флуориметр, нажмите на кнопку метода, которая открывает окно метода анализа.

В поле измерения выберите фотометрию в выпадающем меню. Теперь нажмите на вкладку количественной оценки. В поле Тип количественного определения выберите длину волны, чтобы указать, что показания флуоресценции будут производиться с использованием указанной длины волны.

В качестве типа калибровки выберите первый порядок, а в качестве количества длин волн выберите одну. Введите нанограммы на миллилитр для единицы концентрации. Убедитесь, что ручная калибровка и кривая силы через нулевые поля не проверяются для цифры После запятой выберите два, введите ноль для нижнего предела концентрации и 10 000 для верхнего поля предела концентрации.

Далее нажмите на вкладку инструмента и в поле режима данных выберите флуоресценцию. Убедитесь, что поле скорости прерывания неактивно, так как оно используется только для измерения фосфоресценции. В поле режима длины волны выберите оба WL фиксированные в поле ex WL one, введите 480 нанометров в поле EM WL one.

Введите 520 нанометров. Оставьте все остальные поля в полях EX и EM неактивными. Установите EX щель и EM щель на 5,0 нанометров.

Используя выпадающие меню, оставьте поле перед полем напряжения ФЭУ от одного до 1000 вольт невыбранным. Для напряжения ФЭУ выберите 700 вольт в раскрывающемся меню. Кроме того, выберите два для автоматического расчета статистики номер один для репликаций: 0,1 секунды для времени интеграции и ноль для задержки.

Теперь откройте вкладку монитора и установите поле max оси почему равным 10 000, а поле max почему ось min равным нулю. Затем выберите поле слева от открытой обработки данных после сбора данных и, при необходимости, поле слева от печатного отчета после сбора данных для отчета, который будет распечатан автоматически по окончании измерений. Наконец, чтобы сохранить все выбранные параметры на различных вкладках окна метода анализа, нажмите на вкладку «Общие» и сохраните файл под новым именем в указанном месте.

Нажмите кнопку «ОК», чтобы закрыть это окно. На этом настройка параметров тестирования прибора завершена. Чтобы настроить считыватель микропланшетов, нажмите кнопку MPR, чтобы переместить окно настройки MPR на передний план.

Сначала подбираем скважины под стандарты. Например, нажмите на позицию A one и перетащите мышь на E one. Затем нажмите на стандартную установленную кнопку.

При этом будут выбраны позиции, которые будут использоваться для стандартов, выделенных зеленым цветом. Затем выберите позиции для образцов. Аналогичным образом щелкните и перетащите мышь на соответствующие позиции на пластине, а затем нажмите на кнопку набора образцов, которая автоматически выделит выбранные позиции желтым цветом.

Продолжайте повторять ту же операцию для положений требуемых измерений образца. Загрузить стандарты и информацию об образце в файл переменных, разделенных запятыми, подготовленный ранее. Перейдите на вкладку «Информация о скважине» в окне настройки MPR.

Нажмите кнопку «Загрузить информацию о скважине», и откроется окно проводника Windows для идентификации информации о скважине в формате csv. После загрузки информации окно должно отображаться в виде таблицы. Для того чтобы приготовить рабочий раствор реактива Pico green, добавьте 50 микролитров реактива 200 X pico green в 9,95 миллилитров TE буфера.

Для стандартной кривой готовят серийные разведения двухцепочечной ДНК Lambda в буфере TE для конечных концентраций в диапазоне от одного до 100 нанограмм на миллилитр пипетки по 150 микролитров каждого стандарта в специальные лунки планшета на 96 лунок. Далее пипеткой вносите по 150 микролитров каждого испытуемого образца в соответствующие отведенные для этого лунки планшета. Теперь с помощью мультипипетки добавьте по 150 микролитров зеленого раствора Пико в каждую лунку и перемешайте раствор и образцы ДНК.

Аккуратно инкубируйте пластину в темном месте в течение двух-пяти минут, чтобы развилась реакция. Нажмите на кнопку отображения MPR, чтобы переместить окно настройки MPR в верхнюю часть дисплея, и нажмите кнопку обменной позиции. Платформа для удержания микропланшетов переместится в переднюю часть прибора, откроет дверцу считывателя микропланшетов и поместит пластину 96 лунки на удерживающую платформу, а лунку А — вперед, а дверцу считывателя микропластин закроет.

Нажмите на кнопку начального положения, чтобы поместить первую позицию микропланшета в положение измерения. Нажмите на кнопку дисплея монитора, чтобы переместить измерительное окно в верхнюю часть дисплея. Нажмите на кнопку измерения, чтобы начать измерение стандартов и неизвестных образцов.

Хорошая калибровочная кривая оценивается с использованием различных параметров, предоставляемых программным обеспечением F 7 000. Например, эта идеальная калибровочная кривая, полученная для количественного определения двухцепочечной ДНК с использованием зеленого красителя Pico, имеет рассчитанный коэффициент детерминации 0,99993. Описанная высокопроизводительная система представляет собой последовательную сборку технологий, включающих Pico Green Dye, флуоресцентный спектрофотометр Hitachi F 7000, оснащенный считывателем Microplate и программным обеспечением для автоматизации сбора, хранения, анализа и представления данных.

Комбинация мощных технологий может удовлетворить растущую потребность в точном анализе небольших количеств двухцепочечных изображений. ДНК.