Количественная оценка дцДНК использованием Hitachi F-7000 Флуоресцентный спектрофотометр и PicoGreen Dye
5 ноября 2010 г.
Демонстрация количественное двухцепочечной ДНК с использованием молекулярных зондов PicoGreen красителя и Hitachi F-7000 флуоресценции Спектрофотометр оснащен аксессуар микропланшетов читателя.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать способность флуоресцентного спектрофотометра F 7 000 со считывателем микропланшетов выполнять количественное определение двухцепочечной ДНК с использованием зеленого красителя Pico. Это достигается путем предварительной подготовки образцов и реагентов. Вторым этапом процедуры является настройка инструмента.
Третьим этапом процедуры является загрузка образцов в считыватель Microplate. Заключительным этапом процедуры является выполнение измерения стандартов и образцов. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие линейную калибровочную кривую, которая может быть использована для количественного определения двухцепочечной ДНК неизвестных образцов.
Включите флуориметр Hitachi F 7, 000 Spectra, чтобы ксеноновая лампа прогрелась в течение одного часа в программе Excel. Создайте файл со стандартами и образцами данных и сохраните его в значениях, разделенных запятыми, или в формате CSV. Чтобы сначала настроить флуориметр, нажмите на кнопку метода, которая открывает окно метода анализа.
В поле измерения выберите фотометрию в выпадающем меню. Теперь нажмите на вкладку количественной оценки. В поле Тип количественного определения выберите длину волны, чтобы указать, что показания флуоресценции будут производиться с использованием указанной длины волны.
В качестве типа калибровки выберите первый порядок, а в качестве количества длин волн выберите одну. Введите нанограммы на миллилитр для единицы концентрации. Убедитесь, что ручная калибровка и кривая силы через нулевые поля не проверяются для цифры После запятой выберите два, введите ноль для нижнего предела концентрации и 10 000 для верхнего поля предела концентрации.
Далее нажмите на вкладку инструмента и в поле режима данных выберите флуоресценцию. Убедитесь, что поле скорости прерывания неактивно, так как оно используется только для измерения фосфоресценции. В поле режима длины волны выберите оба WL фиксированные в поле ex WL one, введите 480 нанометров в поле EM WL one.
Введите 520 нанометров. Оставьте все остальные поля в полях EX и EM неактивными. Установите EX щель и EM щель на 5,0 нанометров.
Используя выпадающие меню, оставьте поле перед полем напряжения ФЭУ от одного до 1000 вольт невыбранным. Для напряжения ФЭУ выберите 700 вольт в раскрывающемся меню. Кроме того, выберите два для автоматического расчета статистики номер один для репликаций: 0,1 секунды для времени интеграции и ноль для задержки.
Теперь откройте вкладку монитора и установите поле max оси почему равным 10 000, а поле max почему ось min равным нулю. Затем выберите поле слева от открытой обработки данных после сбора данных и, при необходимости, поле слева от печатного отчета после сбора данных для отчета, который будет распечатан автоматически по окончании измерений. Наконец, чтобы сохранить все выбранные параметры на различных вкладках окна метода анализа, нажмите на вкладку «Общие» и сохраните файл под новым именем в указанном месте.
Нажмите кнопку «ОК», чтобы закрыть это окно. На этом настройка параметров тестирования прибора завершена. Чтобы настроить считыватель микропланшетов, нажмите кнопку MPR, чтобы переместить окно настройки MPR на передний план.
Сначала подбираем скважины под стандарты. Например, нажмите на позицию A one и перетащите мышь на E one. Затем нажмите на стандартную установленную кнопку.
При этом будут выбраны позиции, которые будут использоваться для стандартов, выделенных зеленым цветом. Затем выберите позиции для образцов. Аналогичным образом щелкните и перетащите мышь на соответствующие позиции на пластине, а затем нажмите на кнопку набора образцов, которая автоматически выделит выбранные позиции желтым цветом.
Продолжайте повторять ту же операцию для положений требуемых измерений образца. Загрузить стандарты и информацию об образце в файл переменных, разделенных запятыми, подготовленный ранее. Перейдите на вкладку «Информация о скважине» в окне настройки MPR.
Нажмите кнопку «Загрузить информацию о скважине», и откроется окно проводника Windows для идентификации информации о скважине в формате csv. После загрузки информации окно должно отображаться в виде таблицы. Для того чтобы приготовить рабочий раствор реактива Pico green, добавьте 50 микролитров реактива 200 X pico green в 9,95 миллилитров TE буфера.
Для стандартной кривой готовят серийные разведения двухцепочечной ДНК Lambda в буфере TE для конечных концентраций в диапазоне от одного до 100 нанограмм на миллилитр пипетки по 150 микролитров каждого стандарта в специальные лунки планшета на 96 лунок. Далее пипеткой вносите по 150 микролитров каждого испытуемого образца в соответствующие отведенные для этого лунки планшета. Теперь с помощью мультипипетки добавьте по 150 микролитров зеленого раствора Пико в каждую лунку и перемешайте раствор и образцы ДНК.
Аккуратно инкубируйте пластину в темном месте в течение двух-пяти минут, чтобы развилась реакция. Нажмите на кнопку отображения MPR, чтобы переместить окно настройки MPR в верхнюю часть дисплея, и нажмите кнопку обменной позиции. Платформа для удержания микропланшетов переместится в переднюю часть прибора, откроет дверцу считывателя микропланшетов и поместит пластину 96 лунки на удерживающую платформу, а лунку А — вперед, а дверцу считывателя микропластин закроет.
Нажмите на кнопку начального положения, чтобы поместить первую позицию микропланшета в положение измерения. Нажмите на кнопку дисплея монитора, чтобы переместить измерительное окно в верхнюю часть дисплея. Нажмите на кнопку измерения, чтобы начать измерение стандартов и неизвестных образцов.
Хорошая калибровочная кривая оценивается с использованием различных параметров, предоставляемых программным обеспечением F 7 000. Например, эта идеальная калибровочная кривая, полученная для количественного определения двухцепочечной ДНК с использованием зеленого красителя Pico, имеет рассчитанный коэффициент детерминации 0,99993. Описанная высокопроизводительная система представляет собой последовательную сборку технологий, включающих Pico Green Dye, флуоресцентный спектрофотометр Hitachi F 7000, оснащенный считывателем Microplate и программным обеспечением для автоматизации сбора, хранения, анализа и представления данных.
Комбинация мощных технологий может удовлетворить растущую потребность в точном анализе небольших количеств двухцепочечных изображений. ДНК.
Обзор
В данной статье продемонстрирован метод количественного определения двухцепочечной ДНК (дцДНК) с использованием красителя PicoGreen и флуоресцентного спектрофотометра Hitachi F-7000 с микропланшетным ридером. В процедуре описаны подготовка образцов, настройка прибора и процессы измерения для получения линейной калибровочной кривой для количественного анализа дцДНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Флуоресцентная спектроскопия
- Количественное определение ДНК
- Технология микропланшетного ридера
Теоретические основы
- Краситель PicoGreen представляет собой чувствительный флуоресцентный краситель, используемый для количественного определения dsDNA.
- Hitachi F-7000 — это универсальный флуоресцентный спектрофотометр.
- Точное количественное определение ДНК имеет важное значение для различных биологических экспериментов.
- Высокопроизводительные системы упрощают одновременный анализ множества образцов.
Цель исследования
- Продемонстрировать возможности спектрофотометра F-7000 для количественного определения dsDNA.
- Разработать надежный метод измерения неизвестных образцов ДНК.
- Построить линейную калибровочную кривую для точного количественного анализа.
Используемые методы
- Приготовление реагента PicoGreen и стандартов ДНК.
- Настройка параметров спектрофотометра Hitachi F-7000.
- Загрузка образцов в планшетный ридер.
- Измерение флуоресценции для построения калибровочной кривой.
Основные результаты
- Для количественного определения dsDNA была построена линейная калибровочная кривая.
- Метод продемонстрировал высокую чувствительность и точность.
- Результаты показали коэффициент детерминации 0,99993.
- Система эффективно анализировала малые количества dsDNA.
Выводы
- Комбинация красителя PicoGreen и спектрофотометра F-7000 представляет собой надежный метод количественного определения ДНК.
- Этот высокопроизводительный подход отвечает требованиям к точности анализа в биологических исследованиях.
- Данный метод может быть применен в различных исследованиях, требующих точных измерений содержания ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное количественное определение двухцепочечной ДНК является основополагающим требованием для валидации мишеней, разработки анализов и создания доклинических моделей в сфере биофармацевтических исследований и разработок. Флуоресцентный спектрофотометр Hitachi F-7000 с использованием красителя PicoGreen обеспечивает высокочувствительное и высокопроизводительное измерение dsDNA, что позволяет надежно строить стандартные кривые для последующих приложений. Данный метод обеспечивает прогностическую достоверность количественного анализа нуклеиновых кислот, снижая вариативность в рабочих процессах на ранних стадиях поиска и позволяя масштабировать воспроизводимое получение данных при скрининге соединений и исследованиях биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает точное измерение концентрации днДНК для клонирования, трансфекции и анализа валидации мишеней с помощью ПЦР.
- Практическая ценность: поддерживает воспроизводимую подготовку и количественное определение образцов, снижая техническую вариабельность в экспериментах по проверке гипотез.
- Прогностическая ценность: позволяет строить линейные калибровочные кривые с высокими коэффициентами детерминации (R² > 0.999), что гарантирует точный количественный анализ неизвестных образцов в исследованиях взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественные показатели флуоресценции, совместимые с 96-луночными форматами, для стандартизации анализа и титрования реагентов.
- Практическая ценность: позволяет быстро измерять 96 лунок менее чем за 60 секунд в кинетическом режиме, что обеспечивает готовность к высокопроизводительному скринингу.
- Масштабируемость: программное обеспечение позволяет сохранять и вызывать конфигурации микропланшетов, что облегчает единообразную настройку анализа для различных групп и проектов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает надежный количественный анализ dsDNA для исследования биомаркеров, валидации ПЦР и производства векторов в доклинических моделях.
- Минимизация рисков: высокая чувствительность (50 пикомолей эквивалента флуоресцеина) и широкий динамический диапазон (5 порядков величины) позволяют точно проводить количественную оценку серий разведений, сокращая число ложноотрицательных результатов для мишеней с низкой экспрессией.
- Интеграция в рабочий процесс: вывод данных в формат Excel или отчеты обеспечивает беспрепятственную передачу в биоинформационные и аналитические конвейеры.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров до доклинических разработок, где точное количественное определение нуклеиновых кислот имеет решающее значение для воспроизводимости экспериментов и целостности данных.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез, обеспечивая точное измерение dsDNA для оценки эффективности клонирования, анализа экспрессии генов и исследований мутагенеза.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели флуоресценции, что гарантирует надежность анализа и позволяет проводить нормализацию библиотек соединений.
- Аналитика: позволяет строить линейные калибровочные кривые и определять коэффициенты детерминации (R²), что необходимо для сравнения результатов различных экспериментов и контроля качества.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность на доклиническом этапе за счет надежного количественного определения DNA в лекарственных препаратах, вирусных векторах и биомаркерных анализах.
- Корпоративное повторное использование: настраиваемое программное обеспечение и стандартизированные протоколы позволяют использовать методику в разных подразделениях, сокращая необходимость повторной разработки методов и повышая операционную эффективность.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Высокая чувствительность и специфичность к dsDNA снижают количество ложных сигналов и повышают достоверность данных в молекулярных анализах.
- Операционная ценность: Автоматизированный сбор, хранение и представление данных с помощью программного обеспечения сводят к минимуму ручные операции и ошибки при переносе данных.
- Стратегическая ценность: Надежное количественное определение поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки при оптимизации ведущих соединений, обеспечивая точное дозирование и нормализацию в функциональных анализах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков, предоставляя достоверные данные о нуклеиновых кислотах для отбора кандидатов и исследований по разработке лекарственных форм.
Особенности реализации
- Требуется владение методами флуоресцентной спектроскопии и навыками работы с планшетным ридером.
- Необходим доступ к спектрофотометру Hitachi F-7000 с аксессуаром для чтения микропланшетов и совместимым программным обеспечением.
- Требуется стандартизированная подготовка реагентов (разведение PicoGreen в TE-буфере) и соответствующее обращение с образцами во избежание тушения флуоресценции.
- Включает оптимизацию времени инкубации (2–5 минут в темноте) и настроек длины волны (Ex 480 nm, Em 520 nm) для обеспечения стабильности сигнала.
- Включает практические ограничения, такие как необходимость инкубации в темноте и возможность влияния загрязнителей или органических растворителей.
