Визуализация взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК Site-specifically модифицированных λ на уровне одной молекулы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области визуализации одномолекулярных взаимодействий белков ДНК, таких как репликация ДНК, репарация генов и поддержание структуры хромосом. Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно получить модифицированную лямбда-ДНК с высоким содержанием коллагена, а затем быстро вылечить меченые белки. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы сборки проточной ячейки сложны для изучения.

Чтобы почистить покровные листы, поместите 20 покровных стеблей в четыре банки для окрашивания, насыпьте в них этанол и обработайте ультразвуком в течение 30 минут. Затем промойте покровные стекла сверхчистой водой три раза. Затем просните покровные стекла одним моляром гидроксидом калия в течение 30 минут и трижды промойте их сверхчистой водой.

Затем повторите ультразвуковую обработку этанолом и гидроксидом калия один раз. Пропитайте покровные стекла ацетоном в течение 30 минут, а затем тщательно промойте ультрачистой водой. Теперь поместите покровные стекла в раствор пираньи и выдерживайте при температуре 95 градусов Цельсия в течение часа.

После инкубации промойте покровные стекла ультрачистой водой пять раз. Затем тщательно промойте каждый покровный стекло сверхчистой водой. Используйте бумагу, чтобы высушить покровный лист с его края, и поместите его в банку для окрашивания.

Тщательно просушите покровное стекло в духовке при температуре 110 градусов Цельсия. Теперь промойте покровное стекло метанолом, а затем поместите баночку для окрашивания обратно в духовку при температуре 110 градусов Цельсия, чтобы высушить покровное стекло. Чтобы выполнить функционализацию покровного стекла, добавьте в каждую банку по 70 миллилитров раствора силана, закрутите крышку и оставьте банку при комнатной температуре на ночь.

Вымойте покровные стекла с помощью трех стаканов, наполненных сверхчистой водой. Тщательно просушите покровные стекла с помощью газообразного азота. Растворите 150 миллиграммов метокси-ПЭГ и шесть миллиграммов биотин-ПЭГ в одном миллилитре свежеприготовленного 0,1 молярного бикарбоната натрия.

Центрифугируйте при 17 000 раз g в течение одной минуты, чтобы удалить нерастворимые ПЭГ. Теперь нанесите пипетку на 100 микролитров раствора PEG в центр силанизированного покровного стекла и поместите еще одну силанизированную защитную крышку сверху. Инкубируйте покровные стекла с раствором PEG не менее трех часов в темноте.

Разделите пары покровных крышек и держите функционализированную поверхность лицевой стороной вверх. Тщательно промойте покровные стекла в ультрачистой воде и высушите их газообразным азотом. Теперь отметьте функционализированную сторону покровных листов на одном из углов маркером.

Поместите один покровный стекло в 50-миллилитровую трубку, просверленную с одним отверстием на крышке. Поместите тюбик в полиэтиленовый пакет, запечатайте пакет с помощью вакуумного упаковщика и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы собрать проточную ячейку, вырежьте канал в центре куска двустороннего скотча с помощью перфоратора.

Снимите с бумажной стороны двусторонний скотч и наклейте его на стеклянную сторону с двумя отверстиями. Пузырьки воздуха легче удалить, отклеив бумажную сторону, чем пластиковую сторону двустороннего скотча. Прижмите ленту, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Затем разрежьте функционализированную покровную крышку на четыре части с помощью стеклянной палочки с алмазным наконечником и удалите мусор с помощью газообразного азота, держа функционализированную сторону вверх. Снимите пластиковую сторону двустороннего скотча и наклейте предметное стекло на функционализированный покровный скот. Осторожно нажмите, чтобы удалить пузырьки воздуха между покровным стеклом и лентой.

Тщательное удаление пузырьков воздуха может защитить проточную ячейку от утечки во время закачки в нее буферов. Теперь вставьте входную трубку в маленькое отверстие и вставьте выходную трубку в большое отверстие. Закрепите трубку с помощью эпоксидной смолы.

Вручную закачайте 20 микролитров 0,2 миллиграмма на миллилитр стрептавидина в проточную ячейку с помощью шприца и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем закачайте блокирующий буфер в проточную ячейку для замены стрептавидина и поддерживайте его при комнатной температуре. Получение фокусного выравнивания красного и дальнего красного с помощью A5 на испытательном стекле флуоресцентного микроскопа номер один путем одновременного возбуждения с помощью лазера с яркостью 532 нм и лазера с яркостью 640 нм.

Создание изображений с двумя длинами волн с помощью разделяющей оптики. Поместите проточную ячейку на микроскоп и подсоедините ее выходную трубку к более длинной трубке, которая подключена к пружине объемом 10 миллилитров, установленной на автоматизированном программируемом насосе для вывода инфузии. Удалите пузырьки воздуха в проточной камере, впрыскав блокирующий буфер и перевернув выпускную трубку.

Добавьте 0,5 микролитра биотинилированной ДНК лямбда-ARS317 в 80 микролитров блокирующего буфера. Закачивайте приготовленную смесь в проточную ячейку со скоростью 25 микролитров в минуту в течение двух минут. Затем промойте ДНК лямбда-ARS317 с помощью 200 микролитров блокирующего буфера со скоростью 50 микролитров в минуту.

Теперь закачайте 200 микролитров связующего буфера со скоростью 50 микролитров в минуту, чтобы удалить блокирующий буфер в проточной камере. Затем добавьте два микролитра ORC-Qdot705, один микролитр DTT и один микролитр АТФ в 96 микролитров связывающего буфера. Конечная концентрация ORC-Qdot705 составляет 0,2 наномоляра.

После закачки связующего буфера, как подробно описано в текстовом протоколе, закачайте в проточную ячейку 20 микролитров приготовленного раствора ORC-Qdot705 со скоростью 10 микролитров в минуту. Удалите излишки ORC-Qdot705 с помощью 200 микролитров связующего буфера со скоростью 100 микролитров в минуту. Затем закачайте связывающий буфер с 30 наномолярами SYTOX Orange в проточную ячейку для окрашивания субстратов ДНК со скоростью 100 микролитров в минуту.

Наконец, возбуждайте сигнал ORC-Qdot705 с помощью лазера с горизонтом 405 нм и возбуждайте сигнал окрашенной ДНК SYTOX Orange с помощью лазера с яркостью 532 нм. Наблюдайте за сигналами одновременно со скоростью потока 100 микролитров в минуту с помощью четырехполосного полосового фильтра. Записывайте изображения с помощью EMCCD со скоростью 100 миллисекунд на кадр.

Иллюстрация субстрата ДНК lambda-ARS317 показана здесь. ORC с маркировкой Qdot705 возбуждался лазером с яркостью 405 нанометров. SYTOX Окрашенная в оранжевый цвет ДНК возбуждалась лазером с яркостью 532 нанометра.

Объединенный результат позволяет предположить, что меченый Qdot705 ORC связывается с ARS317. Результат ORC-связывающего распределения на ДНК лямбда-ARS317 показывает, что ORC связывается в ARS317 с высокой численностью. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как одномолекулярный FRET, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся белок-белковых взаимодействий и белковой динамики.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области флуоресцентной визуализации с помощью одной молекулы к изучению взаимодействий белков ДНК в восстановленных системах репликации ДНК и репарации ДНК in vitro. Не забывайте, что работа с раствором Piranha может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных масок для лица.