Высокая пропускная способность Количественный RT-PCR в одиночных и массовых C. elegans образцы с использованием нанофлюидных технологий

Наш протокол повысил как пропускную способность, так и эффективность времени для получения данных ОТ-кПЦР непосредственно из одного или небольших образцов без необходимости выделения РНК. Используя этот протокол, можно получить более 9 000 результатов ОТ-кПЦР всего за два дня стендовой работы, что обычно занимает около пяти недель при использовании стандартной 96-луночной кПЦР. Этот протокол обеспечивает более быстрый, надежный и высокочувствительный анализ ОТ-кПЦР у C.elegans, который идеально подходит для мониторинга межиндивидуальной изменчивости экспрессии генов между изогенными червями.

Начните с того, что высадите червей с их бактериальной лужайки на свежую незасеянную нематоду и дайте червям перемещаться по тарелке в течение пяти минут. Пока черви акклиматизируются, в колпаке без РНКазы смешайте 10 микролитров буфера для лизиса с 1 до 100 Dnase I на образец и положите крышку ПЦР-полоски вверх ногами на платформу препарирующего эндоскопа. Затем добавьте 10 микролитров смеси для лизиса в куполообразные крышки пробирок для ПЦР и зачерпните червей из пластины, чтобы избежать переноса бактерий в каждую щель крышки.

Когда все черви будут перенесены, закройте крышки и вращайте трубки в течение пяти секунд, прежде чем поместить трубки в колбу Дьюара с жидким азотом. По прошествии последних пяти секунд разморозьте трубки на водяной бане при температуре 40 градусов Цельсия, а затем повторите процедуру замораживания/размораживания еще девять раз. После последнего цикла замораживания/оттаивания смешайте лизированные образцы на термическом миксере в течение 20–30 минут при температуре четыре градуса Цельсия и примерно 1800 оборотов в минуту.

В конце инкубации смешивания уменьшите количество образцов, как показано на рисунке, и добавьте по одному микролитру только что размороженного раствора в каждую пробирку. Для обратной транскрипции объемных теплых образцов в колпаке без РНКазы приготовьте мастер-смесь ферментного буфера и добавьте 14 микролитров мастер-смеси к 11 микролитрам каждого образца. Пропустите образцы через термоамплификатор с использованием указанной программы обратной транскрипции и разбавьте полученный продукт кДНК в соотношении один к четырем в воде, не содержащей нуклеаз.

Для целевой специфической предварительной амплификации добавьте 3,75 микролитра мастер-смеси предварительной амплификации в одну лунку на образец в 96-луночном планшете и добавьте по 1,25 микролитра каждого раствора кДНК в каждую лунку мастер-смеси. Когда все образцы будут загружены, накройте планшет уплотнительной лентой и кратковременно оберните образцы перед их вращением с помощью центрифугирования, затем загрузите планшет в термоамплификатор и запустите программу, как показано. Чтобы удалить невключенные праймеры из системы предварительного усиления, в конце термоцикла центрифугируйте планшет с образцом и осторожно снимите уплотнение.

Добавьте два микролитра экзонуклеазы I master mix в каждую реакцию предварительной амплификации и снова запечатайте, центрифугируйте и загрузите планшет обратно в термоциклер. В конце цикла разбавьте образцы 18 микролитрами буфера Tris-EDTA. Чтобы настроить многоматричный чип, добавьте 3,6 микролитра мастер-смеси для загрузки анализа и 0,4 микролитра 50 микромолярного прямого обратного праймера в одну лунку на образец в 384-луночном планшете.

Затем добавьте по 2,2 микролитра образца мастер-смеси и по 1,8 микролитра каждой предварительно амплифицированной экзонуклеазы обработанного образца в соответствующие лунки планшета. Чтобы настроить одноматричный чип, добавьте 5,4 микролитра мастер-смеси для загрузки анализа и 0,6 микролитра прямого обратного праймера в одну лунку на образец второго 384-луночного планшета, затем добавьте 3,3 микролитра мастер-смеси образца и 2,7 микролитра каждой предварительно амплифицированной экзонуклеазы, обработанной мною образцом, в соответствующие лунки подготовленного одноматричного планшета. Чтобы подготовить нанофлюидный чип к первому запуску, удерживая чип под углом 45 градусов, медленно и осторожно введите 150 микролитров жидкости управляющей линии в аккумуляторы чипа.

Когда вся жидкость будет загружена, снимите синюю защитную пленку с нижней части чипа и поместите чип в машину для праймирования нанофлюидики ПЦР штрих-кодом наружу. Затем запустите скрипт Prime(153x). После грунтовки поместите чип на темную поверхность и по мере загрузки каждого анализа или смеси образцов удалите соответствующие барьерные пробки, если это необходимо, и добавьте соответствующий объем анализа или смеси образцов к соответствующим входным отверстиям наножидкостного чипа в соответствии с планом эксперимента.

После загрузки поместите чип в наножидкостный амплификатор и запустите соответствующий протокол в программном обеспечении для сбора данных. Если не используется вся микросхема с несколькими чипами, выполните прогон после скрипта, чтобы разрешить использование оставшихся массивов микросхем в нисходящем потоке. Чтобы проверить, является ли протокол «червь-кт» действительным методом экстракции кДНК, метод сравнивали со стандартными методами экстракции тиоцианата-фенол-хлороформа гуанидиума.

В глобальном масштабе уровни экспрессии мРНК hsp-70 на 100 нанограммов общей РНК были сопоставимы как с использованием фенол-хлороформа, так и методом «червь-к-Ct». Однако в случаях самой высокой экспрессии hsp-70 экспрессия была выше при использовании метода «червь-кт», что указывает на улучшенную чувствительность. При экстракции тиоцианата-фенол-хлороформа гуанидии в объемных образцах hsp-70 снизился на 82,7 у мутантов hsf-1 по сравнению с контролем и на 92,3% при теплом до Ct, что указывает на то, что снижение было сопоставимым между двумя методами.

Используя кДНК, полученную либо из объемных образцов из 25 червей, либо в среднем из 36 образцов одного червя, методы обнаружили сопоставимые уровни экспрессии для всех протестированных шаперонов, что указывает на то, что параметры, полученные от отдельных червей, являются надежными. Здесь показана средняя экспрессия множественных транскриптов hsp от одиночных червей после короткого теплового шока. Как было замечено, вариабельность экспрессии транскриптов существенно различается в зависимости от гена.

Для каждого транскрипта, протестированного с использованием образцов одного червя, технические коэффициенты вариабельности были ниже, чем биологические коэффициенты вариабельности, что указывает на то, что технические тройки не требовались для оценки параметров при проведении количественной ПЦР на отдельных червях. При выполнении этого протокола важно точно пипетировать небольшие объемы и не допускать обратного пипетирования в нанофлюидный чип. Этот протокол может быть использован для получения больших наборов данных RT-qPCR, которые затем могут быть экспортированы и обработаны по желанию с помощью сценариев Excel или R.